El nematodo del pino es un endoparásito migratorio cuarentenario conocido por causar graves pérdidas económicas en los ecosistemas forestales de pino. El presente estudio revisa la actividad nematicida de los indoles halogenados contra los nematodos del pino y su mecanismo de acción. Las actividades nematicidas del 5-yodoindol y la avermectina (control positivo) contra los nematodos del pino fueron similares y altas a bajas concentraciones (10 μg/mL). El 5-yodoindol redujo la fecundidad, la actividad reproductiva, la mortalidad embrionaria y larvaria, y el comportamiento locomotor. Las interacciones moleculares de los ligandos con los receptores de canales de cloruro dependientes del glutamato específicos de los invertebrados respaldan la noción de que el 5-yodoindol, como la avermectina, se une estrechamente al sitio activo del receptor. El 5-yodoindol también indujo varias deformaciones fenotípicas en los nematodos, incluyendo el colapso/encogimiento anormal de órganos y el aumento de la vacuolización. Estos resultados sugieren que las vacuolas podrían influir en la muerte de nematodos mediada por metilación. Cabe destacar que el 5-yodoindol no fue tóxico para ninguna de las especies de plantas (col y rábano). Por lo tanto, este estudio demuestra que la aplicación de yodoindol en condiciones ambientales puede controlar el daño causado por la marchitez del pino.
El nematodo de la madera de pino (Bursaphelenchus xylophilus) pertenece a los nematodos de la madera de pino (PWN), nematodos endoparásitos migratorios conocidos por causar graves daños ecológicos a los ecosistemas forestales de pino1. La enfermedad del marchitamiento del pino (PWD) causada por el nematodo de la madera de pino se está convirtiendo en un problema grave en varios continentes, incluidos Asia y Europa, y en América del Norte, el nematodo destruye las especies de pino introducidas1,2. El declive de los pinos es un problema económico importante y la perspectiva de su propagación global es preocupante3. Las siguientes especies de pino son las más comúnmente atacadas por el nematodo: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii y Pinus radiata4. El nematodo del pino es una enfermedad grave que puede matar a los pinos en cuestión de semanas o meses después de la infección. Además, los brotes de nematodos del pino son comunes en una variedad de ecosistemas, por lo que se han establecido cadenas de infección persistentes1.
Bursaphelenchus xylophilus es un nematodo fitoparásito cuarentenario perteneciente a la superfamilia Aphelenchoidea y al clado 102.5. Este nematodo se alimenta de hongos y se reproduce en los tejidos leñosos de los pinos, desarrollándose en cuatro estadios larvarios diferentes: L1, L2, L3, L4 y un individuo adulto1,6. En condiciones de escasez de alimento, el nematodo del pino pasa a un estadio larvario especializado, el dauer, que parasita a su vector, el gorgojo descortezador del pino (Monochamus alternatus), y se transfiere a pinos sanos. En huéspedes sanos, los nematodos migran rápidamente a través de los tejidos vegetales y se alimentan de células parenquimatosas, lo que provoca diversas reacciones de hipersensibilidad, marchitez del pino y muerte en el plazo de un año tras la infección1,7,8.
El control biológico de los nematodos del pino ha sido un desafío desde hace mucho tiempo, con medidas de cuarentena que datan del siglo XX. Las estrategias actuales para controlarlos consisten principalmente en tratamientos químicos, como la fumigación de la madera y la implantación de nematicidas en los troncos de los árboles. Los nematicidas más utilizados son la avermectina y el benzoato de avermectina, que pertenecen a la familia de las avermectinas. Estos costosos productos químicos son muy eficaces contra muchas especies de nematodos y se consideran ambientalmente seguros9. Sin embargo, se espera que el uso repetido de estos nematicidas genere una presión selectiva que, casi con seguridad, conducirá a la aparición de nematodos del pino resistentes, como se ha demostrado para varias plagas de insectos, como Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella y los nematodos Trichostrongylus colubriformis y Ostertagia circumcincta, que han desarrollado gradualmente resistencia a las avermectinas10,11,12. Por lo tanto, es necesario estudiar periódicamente los patrones de resistencia y evaluar continuamente los nematicidas para encontrar medidas alternativas, rentables y respetuosas con el medio ambiente para controlar la DVP. En las últimas décadas, varios autores han propuesto el uso de extractos de plantas, aceites esenciales y volátiles como agentes de control de nematodos13,14,15,16.
Recientemente demostramos la actividad nematicida del indol, una molécula de señalización intercelular e interreino, en Caenorhabditis elegans 17 . El indol es una señal intracelular ampliamente distribuida en la ecología microbiana, que controla numerosas funciones que afectan la fisiología microbiana, la formación de esporas, la estabilidad de plásmidos, la resistencia a fármacos, la formación de biopelículas y la virulencia 18, 19 . No se ha estudiado la actividad del indol y sus derivados contra otros nematodos patógenos. En este estudio, investigamos la actividad nematicida de 34 indoles contra nematodos del pino y dilucidamos el mecanismo de acción del 5-yodoindol más potente mediante microscopía, fotografía time-lapse y experimentos de acoplamiento molecular, y evaluamos sus efectos tóxicos en plantas mediante un ensayo de germinación de semillas.
Se ha reportado previamente que altas concentraciones (>1.0 mM) de indol tienen un efecto nematicida sobre nematodos17. Tras el tratamiento de B. xylophilus (estadios biológicos mixtos) con indol o 33 derivados diferentes de indol a 1 mM, se midió la mortalidad de B. xylophilus contando nematodos vivos y muertos en los grupos control y tratado. Cinco indoles mostraron una actividad nematicida significativa; la supervivencia del grupo control sin tratamiento fue del 95 ± 7% después de 24 h. De los 34 indoles evaluados, el 5-yodoindol y el 4-fluoroindol a 1 mM causaron una mortalidad del 100%, mientras que el 5,6-difluoroíndigo, el metilindol-7-carboxilato y el 7-yodoindol causaron aproximadamente una mortalidad del 50% (Tabla 1).
Efecto del 5-yodoindol en la formación de vacuolas y el metabolismo del nematodo de la madera del pino. (A) Efecto de la avermectina y el 5-yodoindol en nematodos macho adultos, (B) Huevos de nematodo en estadio L1 y (C) metabolismo de B. xylophilus. (i) No se observaron vacuolas a las 0 h; el tratamiento resultó en (ii) vacuolas, (iii) acumulación de múltiples vacuolas, (iv) hinchamiento de vacuolas, (v) fusión de vacuolas y (vi) formación de vacuolas gigantes. Las flechas rojas indican hinchamiento de vacuolas, las flechas azules indican fusión de vacuolas y las flechas negras indican vacuolas gigantes. Escala de 50 μm.
Además, este estudio también describió el proceso secuencial de muerte inducida por metano en nematodos del pino (Figura 4C). La muerte metanogénica es un tipo no apoptótico de muerte celular asociada con la acumulación de vacuolas citoplasmáticas prominentes27. Los defectos morfológicos observados en los nematodos del pino parecen estar estrechamente relacionados con el mecanismo de muerte inducida por metano. El examen microscópico en diferentes momentos mostró que se formaron vacuolas gigantes después de 20 h de exposición a 5-yodoindol (0,1 mM). Se observaron vacuolas microscópicas después de 8 h de tratamiento y su número aumentó después de 12 h. Se observaron varias vacuolas grandes después de 14 h. Varias vacuolas fusionadas fueron claramente visibles después de 12 a 16 h de tratamiento, lo que indica que la fusión de vacuolas es la base del mecanismo de muerte metanogénica. Después de 20 horas, se encontraron varias vacuolas gigantes en todo el gusano. Estas observaciones representan el primer informe de metuosis en C. elegans .
En gusanos tratados con 5-yodoindol, también se observó agregación y ruptura de vacuolas (Fig. 5), evidenciada por la flexión del gusano y la liberación de las vacuolas al medio ambiente. También se observó disrupción vacuolar en la membrana de la cáscara, que normalmente se conserva intacta por L2 durante la eclosión (Fig. S2 suplementaria). Estas observaciones respaldan la implicación de la acumulación de líquido y la insuficiencia osmorreguladora, así como de la lesión celular reversible (RCI), en el proceso de formación y supuración de vacuolas (Fig. 5).
Partiendo de la hipótesis del papel del yodo en la formación de vacuolas observada, investigamos la actividad nematicida del yoduro de sodio (NaI) y el yoduro de potasio (KI). Sin embargo, a concentraciones (0,1, 0,5 o 1 mM), no afectaron ni la supervivencia de los nematodos ni la formación de vacuolas (Fig. S5 suplementaria), aunque 1 mM de KI tuvo un ligero efecto nematicida. Por otro lado, el 7-yodoindol (1 o 2 mM), al igual que el 5-yodoindol, indujo múltiples vacuolas y deformaciones estructurales (Fig. S6 suplementaria). Los dos yodoindoles mostraron características fenotípicas similares en los nematodos del pino, mientras que el NaI y el KI no. Curiosamente, el indol no indujo la formación de vacuolas en B. xylophilus a las concentraciones analizadas (datos no mostrados). Así, los resultados confirmaron que el complejo indol-yodo es responsable de la vacuolización y el metabolismo de B. xylophilus.
Entre los indoles analizados para determinar su actividad nematicida, el 5-yodoindol presentó el índice de deslizamiento más alto, de -5,89 kcal/mol, seguido del 7-yodoindol (-4,48 kcal/mol), el 4-fluoroindol (-4,33) y el indol (-4,03) (Figura 6). La fuerte unión de hidrógeno entre el 5-yodoindol y la leucina 218 estabiliza su unión, mientras que todos los demás derivados del indol se unen a la serina 260 mediante enlaces de hidrógeno en la cadena lateral. Entre otros yodoindoles modelados, el 2-yodoindol tiene un valor de enlace de -5,248 kcal/mol, que se debe a su principal enlace de hidrógeno con la leucina 218. Otros enlaces conocidos incluyen 3-yodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-yodoindol (-4,0 kcal/mol) y 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (Figura suplementaria S8). La mayoría de los indoles halogenados y el propio indol, con excepción del 5-yodoindol y el 2-yodoindol, forman un enlace con la serina 260. El hecho de que la unión de hidrógeno con la leucina 218 sea indicativa de una unión eficiente entre el receptor y el ligando, como se observó para la ivermectina (Fig. S7 suplementaria), confirma que el 5-yodoindol y el 2-yodoindol, al igual que la ivermectina, se unen firmemente al sitio activo del receptor GluCL a través de la leucina 218 (Fig. 6 y Fig. S8 suplementaria). Proponemos que esta unión es necesaria para mantener la estructura de poro abierto del complejo GluCL y que, al unirse firmemente al sitio activo del receptor GluCL, el 5-yodoindol, el 2-yodoindol, la avermectina y la ivermectina mantienen abierto el canal iónico y permiten la captación de fluidos.
Acoplamiento molecular de indol e indol halogenado a GluCL. Orientaciones de unión de los ligandos (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-yodoindol y (D) 5-yodoindol al sitio activo de GluCL. La proteína se representa con una cinta y los enlaces de hidrógeno de la cadena principal se muestran con líneas discontinuas amarillas. (A'), (B'), (C') y (D') muestran las interacciones de los ligandos correspondientes con los residuos de aminoácidos circundantes, y los enlaces de hidrógeno de la cadena lateral se indican con flechas discontinuas rosas.
Se realizaron experimentos para evaluar el efecto tóxico del 5-yodoindol en la germinación de semillas de repollo y rábano. El 5-yodoindol (0,05 o 0,1 mM) o la avermectina (10 μg/mL) tuvieron poco o ningún efecto en la germinación inicial y la emergencia de las plántulas (Figura 7). Además, no se encontró diferencia significativa entre la tasa de germinación de los controles sin tratar y las semillas tratadas con 5-yodoindol o avermectina. El efecto en la elongación de la raíz pivotante y el número de raíces laterales formadas fue insignificante, aunque 1 mM (10 veces su concentración activa) de 5-yodoindol retrasó ligeramente el desarrollo de las raíces laterales. Estos resultados indican que el 5-yodoindol no es tóxico para las células vegetales y no interfiere con los procesos de desarrollo de la planta a las concentraciones estudiadas.
Efecto del 5-yodoindol en la germinación de semillas. Germinación, brotación y enraizamiento lateral de semillas de B. oleracea y R. raphanistrum en medio de agar Murashige y Skoog con o sin avermectina o 5-yodoindol. La germinación se registró tras 3 días de incubación a 22 °C.
Este estudio reporta varios casos de nematodos causados por indoles. Cabe destacar que este es el primer informe de metilación inducida por yodoindol (un proceso causado por la acumulación de pequeñas vacuolas que gradualmente se fusionan en vacuolas gigantes, lo que finalmente provoca la ruptura de la membrana y la muerte) en agujas de pino. El yodoindol exhibe propiedades nematicidas significativas, similares a las del nematicida comercial avermectina.
Se ha reportado previamente que los indoles ejercen múltiples funciones de señalización en procariotas y eucariotas, incluyendo la inhibición/formación de biopelículas, la supervivencia bacteriana y la patogenicidad19,32,33,34. Recientemente, los potenciales efectos terapéuticos de los indoles halogenados, los alcaloides indólicos y los derivados semisintéticos del indole han atraído un amplio interés en la investigación35,36,37. Por ejemplo, se ha demostrado que los indoles halogenados destruyen células persistentes de Escherichia coli y Staphylococcus aureus37. Además, es de interés científico estudiar la eficacia de los indoles halogenados contra otras especies, géneros y reinos, y este estudio constituye un paso hacia el logro de este objetivo.
En este trabajo, proponemos un mecanismo para la letalidad inducida por 5-yodoindol en C. elegans basado en la lesión celular reversible (RCI) y la metilación (Figuras 4C y 5). Los cambios edematosos, como la hinchazón y la degeneración vacuolar, son indicadores de RCI y metilación, que se manifiestan como vacuolas gigantes en el citoplasma48,49. La RCI interfiere con la producción de energía al reducir la producción de ATP, lo que causa un fallo de la bomba ATPasa o al alterar las membranas celulares y provocar una rápida entrada de Na+, Ca2+ y agua50,51,52. Las vacuolas intracitoplasmáticas surgen en las células animales como resultado de la acumulación de líquido en el citoplasma debido a la entrada de Ca2+ y agua53. Curiosamente, este mecanismo de daño celular es reversible si el daño es temporal y las células comienzan a producir ATP durante un cierto período de tiempo, pero si el daño persiste o empeora, las células mueren.54 Nuestras observaciones muestran que los nematodos tratados con 5-yodoindol son incapaces de restaurar la biosíntesis normal después de la exposición a condiciones de estrés.
El fenotipo de metilación inducido por el 5-yodoindol en B. xylophilus puede deberse a la presencia de yodo y su distribución molecular, ya que el 7-yodoindol tuvo un menor efecto inhibitorio sobre B. xylophilus que el 5-yodoindol (Tabla 1 y Figura Suplementaria S6). Estos resultados son parcialmente consistentes con los estudios de Maltese et al. (2014), quienes informaron que la translocación de la fracción de nitrógeno piridilico en el indol de la posición para a la meta eliminó la vacuolización, la inhibición del crecimiento y la citotoxicidad en células U251, lo que sugiere que la interacción de la molécula con un sitio activo específico en la proteína es crítica27,44,45. Las interacciones entre el indol o los indoles halogenados y los receptores GluCL observadas en este estudio también respaldan esta idea, ya que se observó que el 5- y el 2-yodoindol se unen a los receptores GluCL con mayor fuerza que los demás indoles examinados (Figura 6 y Figura Suplementaria S8). Se observó que el yodo en la segunda o quinta posición del indol se une a la leucina 218 del receptor GluCL mediante enlaces de hidrógeno en la cadena principal, mientras que otros indoles halogenados y el propio indol forman enlaces de hidrógeno débiles en la cadena lateral con la serina 260 (Figura 6). Por lo tanto, especulamos que la localización del halógeno desempeña un papel importante en la inducción de la degeneración vacuolar, mientras que la estrecha unión del 5-yodoindol mantiene abierto el canal iónico, lo que permite una rápida entrada de fluidos y la ruptura de la vacuola. Sin embargo, aún queda por determinar el mecanismo de acción detallado del 5-yodoindol.
Antes de la aplicación práctica del 5-yodoindol, es necesario analizar su efecto tóxico en las plantas. Nuestros experimentos de germinación de semillas demostraron que el 5-yodoindol no tuvo efectos negativos en la germinación ni en el desarrollo posterior de las semillas a las concentraciones estudiadas (Figura 7). Por lo tanto, este estudio sienta las bases para el uso del 5-yodoindol en el entorno ecológico para controlar la nocividad de los nematodos del pino en los pinos.
Informes previos han demostrado que la terapia basada en indoles representa un enfoque potencial para abordar el problema de la resistencia a los antibióticos y la progresión del cáncer55. Además, los indoles poseen actividades antibacterianas, anticancerígenas, antioxidantes, antiinflamatorias, antidiabéticas, antivirales, antiproliferativas y antituberculosas, y podrían servir como una base prometedora para el desarrollo de fármacos56,57. Este estudio sugiere por primera vez el uso potencial del yodo como agente antiparasitario y antihelmíntico.
La avermectina se descubrió hace tres décadas y ganó el Premio Nobel en 2015. Su uso como antihelmíntico continúa activo. Sin embargo, debido al rápido desarrollo de resistencia a las avermectinas en nematodos y plagas de insectos, se necesita una estrategia alternativa, económica y respetuosa con el medio ambiente para controlar la infección por el nematodo del pino (NMP) en pinos. Este estudio también describe el mecanismo por el cual el 5-yodoindol mata a los nematodos del pino y su baja toxicidad para las células vegetales, lo que abre buenas perspectivas para su futura aplicación comercial.
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Yeungnam, Gyeongsan, Corea, y los métodos se realizaron de acuerdo con las pautas del Comité de Ética de la Universidad Yeungnam.
Se realizaron experimentos de incubación de huevos utilizando procedimientos establecidos43. Para evaluar las tasas de eclosión (HR), se transfirieron nematodos adultos de 1 día de edad (aproximadamente 100 hembras y 100 machos) a placas de Petri que contenían el hongo y se dejaron crecer durante 24 h. Luego, se aislaron los huevos y se trataron con 5-yodoindol (0,05 mM y 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) como una suspensión en agua destilada estéril. Estas suspensiones (500 μl; aproximadamente 100 huevos) se transfirieron a los pocillos de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos y se incubaron a 22 °C. Se realizaron conteos de L2 después de 24 h de incubación, pero se consideraron muertas si las células no se movieron cuando se estimularon con un alambre fino de platino. Este experimento se realizó en dos etapas, cada una con seis repeticiones. Los datos de ambos experimentos se combinaron y presentaron. El porcentaje de FC se calcula de la siguiente manera:
La mortalidad larvaria se evaluó mediante procedimientos previamente desarrollados. Se recolectaron huevos de nematodos y los embriones se sincronizaron mediante eclosión en agua destilada estéril para generar larvas en estadio L2. Las larvas sincronizadas (aproximadamente 500 nematodos) se trataron con 5-yodoindol (0,05 mM y 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) y se criaron en placas de Petri de B. cinerea. Tras 48 h de incubación a 22 °C, se recolectaron los nematodos en agua destilada estéril y se examinaron para detectar la presencia de los estadios L2, L3 y L4. La presencia de los estadios L3 y L4 indicó transformación larvaria, mientras que la presencia del estadio L2 indicó ausencia de transformación. Las imágenes se adquirieron utilizando el sistema de imágenes celulares digitales iRiS™. Este experimento se realizó en dos etapas, cada una con seis repeticiones. Los datos de ambos experimentos se combinaron y presentaron.
La toxicidad del 5-yodoindol y la avermectina en las semillas se evaluó mediante pruebas de germinación en placas de agar Murashige y Skoog.62 Las semillas de B. oleracea y R. raphanistrum se remojaron primero en agua destilada estéril durante un día, se lavaron con 1 ml de etanol al 100%, se esterilizaron con 1 ml de lejía comercial al 50% (hipoclorito de sodio al 3%) durante 15 min y se lavaron cinco veces con 1 ml de agua estéril. Luego, las semillas esterilizadas se presionaron sobre placas de agar de germinación que contenían 0,86 g/l (0,2X) de medio Murashige y Skoog y agar bacteriológico al 0,7% con o sin 5-yodoindol o avermectina. Luego, las placas se incubaron a 22 °C y se tomaron imágenes después de 3 días de incubación. Este experimento se realizó en dos etapas, cada una de las cuales tuvo seis repeticiones.
Hora de publicación: 26 de febrero de 2025