El nematodo del pino es un endoparásito migratorio de cuarentena conocido por causar graves pérdidas económicas en los ecosistemas de bosques de pino. El presente estudio revisa la actividad nematicida de los indoles halogenados contra los nematodos del pino y su mecanismo de acción. Las actividades nematicidas del 5-iodoindol y la avermectina (control positivo) contra los nematodos del pino fueron similares y altas a bajas concentraciones (10 μg/mL). El 5-iodoindol redujo la fecundidad, la actividad reproductiva, la mortalidad embrionaria y larvaria, y el comportamiento locomotor. Las interacciones moleculares de los ligandos con los receptores de canales de cloruro activados por glutamato específicos de invertebrados apoyan la noción de que el 5-iodoindol, al igual que la avermectina, se une fuertemente al sitio activo del receptor. El 5-iodoindol también indujo varias deformaciones fenotípicas en los nematodos, incluyendo colapso/encogimiento anormal de órganos y aumento de la vacuolización. Estos resultados sugieren que las vacuolas podrían desempeñar un papel en la muerte de los nematodos mediada por metilación. Es importante destacar que el 5-iodoindol no fue tóxico para ninguna de las dos especies vegetales (repollo y rábano). Por lo tanto, este estudio demuestra que la aplicación de iodoindol en condiciones ambientales puede controlar los daños causados por la marchitez del pino.
El nematodo de la madera del pino (Bursaphelenchus xylophilus) pertenece a los nematodos de la madera del pino (PWN), nematodos endoparásitos migratorios conocidos por causar graves daños ecológicos a los ecosistemas de los bosques de pino1. La enfermedad de la marchitez del pino (PWD), causada por el nematodo de la madera del pino, se está convirtiendo en un grave problema en varios continentes, incluidos Asia y Europa, y en América del Norte, el nematodo destruye especies de pino introducidas1,2. El declive de los pinos es un importante problema económico, y la perspectiva de su propagación mundial es preocupante3. Las siguientes especies de pino son atacadas con mayor frecuencia por el nematodo: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii y Pinus radiata4. El nematodo del pino es una enfermedad grave que puede matar a los pinos en cuestión de semanas o meses después de la infección. Además, los brotes de nematodos del pino son comunes en una variedad de ecosistemas, por lo que se han establecido cadenas de infección persistentes1.
Bursaphelenchus xylophilus es un nematodo fitoparásito de cuarentena perteneciente a la superfamilia Aphelenchoidea y al clado 102.5. El nematodo se alimenta de hongos y se reproduce en los tejidos leñosos de los pinos, desarrollándose en cuatro estadios larvarios diferentes: L1, L2, L3, L4 y un individuo adulto1,6. En condiciones de escasez de alimento, el nematodo del pino pasa a un estadio larvario especializado – dauer – que parasita a su vector – el escarabajo de la corteza del pino (Monochamus alternatus) y se transfiere a pinos sanos. En huéspedes sanos, los nematodos migran rápidamente a través de los tejidos vegetales y se alimentan de las células parenquimáticas, lo que provoca una serie de reacciones de hipersensibilidad, marchitamiento del pino y muerte en el plazo de un año tras la infección1,7,8.
El control biológico de los nematodos del pino ha sido un desafío constante, con medidas de cuarentena que se remontan al siglo XX. Las estrategias actuales para controlar estos nematodos implican principalmente tratamientos químicos, como la fumigación de la madera y la implantación de nematicidas en los troncos. Los nematicidas más utilizados son la avermectina y el benzoato de avermectina, pertenecientes a la familia de las avermectinas. Estos costosos productos químicos son altamente efectivos contra muchas especies de nematodos y se consideran seguros para el medio ambiente⁹. Sin embargo, se espera que el uso repetido de estos nematicidas genere una presión selectiva que casi con certeza conducirá a la aparición de nematodos del pino resistentes, como se ha demostrado para varias plagas de insectos, como Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella y los nematodos Trichostrongylus colubriformis y Ostertagia circumcincta, que han desarrollado gradualmente resistencia a las avermectinas¹⁰,¹¹,¹². Por lo tanto, es necesario estudiar periódicamente los patrones de resistencia y evaluar continuamente los nematicidas para encontrar medidas alternativas, rentables y respetuosas con el medio ambiente para controlar la PVD. En las últimas décadas, varios autores han propuesto el uso de extractos de plantas, aceites esenciales y compuestos volátiles como agentes de control de nematodos13,14,15,16.
Recientemente demostramos la actividad nematicida del indol, una molécula de señalización intercelular e interreino, en Caenorhabditis elegans 17. El indol es una señal intracelular extendida en la ecología microbiana, que controla numerosas funciones que afectan la fisiología microbiana, la formación de esporas, la estabilidad de plásmidos, la resistencia a fármacos, la formación de biopelículas y la virulencia 18, 19. La actividad del indol y sus derivados contra otros nematodos patógenos no se ha estudiado. En este estudio, investigamos la actividad nematicida de 34 indoles contra nematodos del pino y dilucidamos el mecanismo de acción del 5-iodoindol más potente utilizando microscopía, fotografía de lapso de tiempo y experimentos de acoplamiento molecular, y evaluamos sus efectos tóxicos en plantas utilizando un ensayo de germinación de semillas.
Se ha informado previamente que altas concentraciones (>1,0 mM) de indol tienen un efecto nematicida sobre los nematodos17. Después del tratamiento de B. xylophilus (etapas de vida mixtas) con indol o 33 derivados de indol diferentes a 1 mM, se midió la mortalidad de B. xylophilus contando nematodos vivos y muertos en los grupos control y tratados. Cinco indoles exhibieron una actividad nematicida significativa; la supervivencia del grupo control no tratado fue del 95 ± 7% después de 24 h. De los 34 indoles probados, el 5-iodoindol y el 4-fluoroindol a 1 mM causaron una mortalidad del 100%, mientras que el 5,6-difluoroíndigo, el metilindol-7-carboxilato y el 7-iodoindol causaron aproximadamente una mortalidad del 50% (Tabla 1).
Efecto del 5-iodoindol en la formación de vacuolas y el metabolismo del nematodo de la madera de pino. (A) Efecto de la avermectina y el 5-iodoindol en nematodos machos adultos, (B) huevos de nematodos en estadio L1 y (C) metabolismo de B. xylophilus, (i) no se observaron vacuolas a las 0 h, el tratamiento resultó en (ii) vacuolas, (iii) acumulación de múltiples vacuolas, (iv) hinchazón de vacuolas, (v) fusión de vacuolas y (vi) formación de vacuolas gigantes. Las flechas rojas indican hinchazón de vacuolas, las flechas azules indican fusión de vacuolas y las flechas negras indican vacuolas gigantes. Barra de escala = 50 μm.
Además, este estudio también describió el proceso secuencial de muerte inducida por metano en nematodos de pino (Figura 4C). La muerte metanogénica es un tipo de muerte celular no apoptótica asociada con la acumulación de prominentes vacuolas citoplasmáticas27. Los defectos morfológicos observados en los nematodos de pino parecen estar estrechamente relacionados con el mecanismo de muerte inducida por metano. El examen microscópico en diferentes momentos mostró que se formaron vacuolas gigantes después de 20 h de exposición a 5-iodoindol (0,1 mM). Se observaron vacuolas microscópicas después de 8 h de tratamiento, y su número aumentó después de 12 h. Se observaron varias vacuolas grandes después de 14 h. Varias vacuolas fusionadas fueron claramente visibles después de 12–16 h de tratamiento, lo que indica que la fusión de vacuolas es la base del mecanismo de muerte metanogénica. Después de 20 horas, se encontraron varias vacuolas gigantes en todo el gusano. Estas observaciones representan el primer informe de metuosis en C. elegans.
En los gusanos tratados con 5-iodoindol, también se observó agregación y ruptura de vacuolas (Fig. 5), evidenciada por la flexión del gusano y la liberación de vacuolas al medio ambiente. Asimismo, se observó la ruptura de vacuolas en la membrana de la cáscara del huevo, que normalmente se mantiene intacta por L2 durante la eclosión (Fig. S2 complementaria). Estas observaciones respaldan la implicación de la acumulación de fluidos y la falla osmorreguladora, así como la lesión celular reversible (LCR), en el proceso de formación y supuración de vacuolas (Fig. 5).
Planteando la hipótesis del papel del yodo en la formación de vacuolas observada, investigamos la actividad nematicida del yoduro de sodio (NaI) y del yoduro de potasio (KI). Sin embargo, a concentraciones de 0,1, 0,5 o 1 mM, no afectaron ni la supervivencia de los nematodos ni la formación de vacuolas (Figura S5 complementaria), aunque 1 mM de KI tuvo un ligero efecto nematicida. Por otro lado, el 7-yodoindol (1 o 2 mM), al igual que el 5-yodoindol, indujo múltiples vacuolas y deformaciones estructurales (Figura S6 complementaria). Los dos yodoindoles mostraron características fenotípicas similares en los nematodos del pino, mientras que el NaI y el KI no. Curiosamente, el indol no indujo la formación de vacuolas en B. xylophilus a las concentraciones probadas (datos no mostrados). De este modo, los resultados confirmaron que el complejo indol-yodo es responsable de la vacuolización y el metabolismo de B. xylophilus.
Entre los indoles analizados por su actividad nematicida, el 5-iodoindol presentó el índice de deslizamiento más alto, de -5,89 kcal/mol, seguido del 7-iodoindol (-4,48 kcal/mol), el 4-fluoroindol (-4,33) y el indol (-4,03) (Figura 6). El fuerte enlace de hidrógeno del esqueleto peptídico del 5-iodoindol con la leucina 218 estabiliza su unión, mientras que todos los demás derivados del indol se unen a la serina 260 mediante enlaces de hidrógeno de la cadena lateral. Entre otros yodoindoles modelados, el 2-yodoindol tiene un valor de unión de -5,248 kcal/mol, debido a su principal enlace de hidrógeno con la leucina 218. Otras uniones conocidas incluyen el 3-yodoindol (-4,3 kcal/mol), el 4-yodoindol (-4,0 kcal/mol) y el 6-fluoroindol (-2,6 kcal/mol) (Figura complementaria S8). La mayoría de los indoles halogenados y el indol mismo, con la excepción del 5-iodoindol y el 2-iodoindol, forman un enlace con la serina 260. El hecho de que el enlace de hidrógeno con la leucina 218 sea indicativo de una unión eficiente receptor-ligando, como se observa para la ivermectina (Figura S7 complementaria), confirma que el 5-iodoindol y el 2-iodoindol, al igual que la ivermectina, se unen firmemente al sitio activo del receptor GluCL a través de la leucina 218 (Figura 6 y Figura S8 complementaria). Proponemos que esta unión es necesaria para mantener la estructura de poro abierto del complejo GluCL y que, al unirse firmemente al sitio activo del receptor GluCL, el 5-iodoindol, el 2-iodoindol, la avermectina y la ivermectina mantienen abierto el canal iónico y permiten la absorción de fluidos.
Acoplamiento molecular de indol e indol halogenado a GluCL. Orientaciones de unión de los ligandos (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-iodoindol y (D) 5-iodoindol al sitio activo de GluCL. La proteína está representada por una cinta y los enlaces de hidrógeno del esqueleto se muestran como líneas punteadas amarillas. (A′), (B′), (C′) y (D′) muestran las interacciones de los ligandos correspondientes con los residuos de aminoácidos circundantes, y los enlaces de hidrógeno de la cadena lateral se indican con flechas punteadas rosas.
Se realizaron experimentos para evaluar el efecto tóxico del 5-iodoindol en la germinación de semillas de repollo y rábano. El 5-iodoindol (0,05 o 0,1 mM) o la avermectina (10 μg/mL) tuvieron poco o ningún efecto en la germinación inicial y la emergencia de plántulas (Figura 7). Además, no se encontró ninguna diferencia significativa entre la tasa de germinación de los controles no tratados y las semillas tratadas con 5-iodoindol o avermectina. El efecto sobre la elongación de la raíz principal y el número de raíces laterales formadas fue insignificante, aunque 1 mM (10 veces su concentración activa) de 5-iodoindol retrasó ligeramente el desarrollo de las raíces laterales. Estos resultados indican que el 5-iodoindol no es tóxico para las células vegetales y no interfiere con los procesos de desarrollo de las plantas en las concentraciones estudiadas.
Efecto del 5-iodoindol en la germinación de semillas. Germinación, brotación y enraizamiento lateral de semillas de B. oleracea y R. raphanistrum en medio de agar Murashige y Skoog con o sin avermectina o 5-iodoindol. La germinación se registró después de 3 días de incubación a 22 °C.
Este estudio reporta varios casos de eliminación de nematodos por indoles. Es importante destacar que este es el primer reporte de metilación inducida por yodoindol (un proceso causado por la acumulación de pequeñas vacuolas que se fusionan gradualmente en vacuolas gigantes, lo que finalmente conduce a la ruptura de la membrana y la muerte) en agujas de pino, donde el yodoindol exhibe propiedades nematicidas significativas similares a las del nematicida comercial avermectina.
Se ha informado previamente que los indoles ejercen múltiples funciones de señalización en procariotas y eucariotas, incluyendo la inhibición/formación de biopelículas, la supervivencia bacteriana y la patogenicidad19,32,33,34. Recientemente, los posibles efectos terapéuticos de los indoles halogenados, los alcaloides indólicos y los derivados semisintéticos de indol han atraído un gran interés de investigación35,36,37. Por ejemplo, se ha demostrado que los indoles halogenados eliminan células persistentes de Escherichia coli y Staphylococcus aureus37. Además, es de interés científico estudiar la eficacia de los indoles halogenados contra otras especies, géneros y reinos, y este estudio es un paso hacia la consecución de este objetivo.
Aquí, proponemos un mecanismo para la letalidad inducida por 5-iodoindol en C. elegans basado en la lesión celular reversible (RCI) y la metilación (Figuras 4C y 5). Los cambios edematosos, como la hinchazón y la degeneración vacuolar, son indicadores de RCI y metilación, que se manifiestan como vacuolas gigantes en el citoplasma48,49. La RCI interfiere con la producción de energía al reducir la producción de ATP, causando la falla de la bomba ATPasa o alterando las membranas celulares y causando un influjo rápido de Na+, Ca2+ y agua50,51,52. Las vacuolas intracitoplasmáticas surgen en las células animales como resultado de la acumulación de líquido en el citoplasma debido al influjo de Ca2+ y agua53. Curiosamente, este mecanismo de daño celular es reversible si el daño es temporal y las células comienzan a producir ATP durante un cierto período de tiempo, pero si el daño persiste o empeora, las células mueren.54 Nuestras observaciones muestran que los nematodos tratados con 5-iodoindol no pueden restaurar la biosíntesis normal después de la exposición a condiciones de estrés.
El fenotipo de metilación inducido por 5-iodoindol en B. xylophilus puede deberse a la presencia de yodo y su distribución molecular, ya que 7-iodoindol tuvo un efecto inhibitorio menor sobre B. xylophilus que 5-iodoindol (Tabla 1 y Figura suplementaria S6). Estos resultados son parcialmente consistentes con los estudios de Maltese et al. (2014), quienes informaron que la translocación de la porción de nitrógeno piridílico en el indol de la posición para a la meta abolió la vacuolización, la inhibición del crecimiento y la citotoxicidad en células U251, lo que sugiere que la interacción de la molécula con un sitio activo específico en la proteína es crítica27,44,45. Las interacciones entre el indol o los indoles halogenados y los receptores GluCL observadas en este estudio también respaldan esta noción, ya que se encontró que el 5- y el 2-yodoindol se unen a los receptores GluCL con mayor afinidad que los otros indoles examinados (Figura 6 y Figura suplementaria S8). Se encontró que el yodo en la segunda o quinta posición del indol se une a la leucina 218 del receptor GluCL mediante enlaces de hidrógeno en la cadena principal, mientras que otros indoles halogenados y el propio indol forman enlaces de hidrógeno débiles en la cadena lateral con la serina 260 (Figura 6). Por lo tanto, especulamos que la localización del halógeno juega un papel importante en la inducción de la degeneración vacuolar, mientras que la fuerte unión del 5-yodoindol mantiene abierto el canal iónico, permitiendo así una rápida entrada de fluido y la ruptura de la vacuola. Sin embargo, el mecanismo de acción detallado del 5-yodoindol aún está por determinar.
Antes de la aplicación práctica del 5-iodoindol, es necesario analizar su toxicidad en las plantas. Nuestros experimentos de germinación de semillas demostraron que el 5-iodoindol no tuvo efectos negativos sobre la germinación ni sobre los procesos de desarrollo posteriores en las concentraciones estudiadas (Figura 7). Por lo tanto, este estudio sienta las bases para el uso del 5-iodoindol en el medio ambiente para controlar la toxicidad de los nematodos del pino en los pinos.
Informes previos han demostrado que la terapia basada en indoles representa un enfoque potencial para abordar el problema de la resistencia a los antibióticos y la progresión del cáncer.55 Además, los indoles poseen actividades antibacterianas, anticancerígenas, antioxidantes, antiinflamatorias, antidiabéticas, antivirales, antiproliferativas y antituberculosas, y pueden servir como una base prometedora para el desarrollo de fármacos.56,57 Este estudio sugiere por primera vez el uso potencial del yodo como agente antiparasitario y antihelmíntico.
La avermectina fue descubierta hace tres décadas y galardonada con el Premio Nobel en 2015; su uso como antihelmíntico continúa vigente. Sin embargo, debido al rápido desarrollo de resistencia a las avermectinas en nematodos e insectos plaga, se necesita una estrategia alternativa, económica y respetuosa con el medio ambiente para controlar la infección por nematodos de la madera del pino (PWN, por sus siglas en inglés). Este estudio también describe el mecanismo por el cual el 5-iodoindol elimina los nematodos del pino y demuestra su baja toxicidad para las células vegetales, lo que abre buenas perspectivas para su futura aplicación comercial.
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Yeungnam, Gyeongsan, Corea, y los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Ética de la Universidad de Yeungnam.
Los experimentos de incubación de huevos se realizaron utilizando procedimientos establecidos43. Para evaluar las tasas de eclosión (TH), nematodos adultos de 1 día de edad (aproximadamente 100 hembras y 100 machos) se transfirieron a placas de Petri que contenían el hongo y se dejaron crecer durante 24 h. Luego, los huevos se aislaron y se trataron con 5-iodoindol (0,05 mM y 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) como una suspensión en agua destilada estéril. Estas suspensiones (500 μl; aproximadamente 100 huevos) se transfirieron a los pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos y se incubaron a 22 °C. Los recuentos L2 se hicieron después de 24 h de incubación, pero se consideraron muertos si las células no se movían al estimularlas con un alambre fino de platino. Este experimento se realizó en dos etapas, cada una con seis repeticiones. Los datos de ambos experimentos se combinaron y se presentaron. El porcentaje de HR se calcula de la siguiente manera:
La mortalidad larvaria se evaluó utilizando procedimientos previamente desarrollados. Se recolectaron huevos de nematodos y se sincronizaron los embriones mediante eclosión en agua destilada estéril para generar larvas en estadio L2. Las larvas sincronizadas (aproximadamente 500 nematodos) se trataron con 5-iodoindol (0,05 mM y 0,1 mM) o avermectina (10 μg/ml) y se criaron en placas de Petri de B. cinerea. Después de 48 h de incubación a 22 °C, los nematodos se recolectaron en agua destilada estéril y se examinaron para detectar la presencia de estadios L2, L3 y L4. La presencia de los estadios L3 y L4 indicó transformación larvaria, mientras que la presencia del estadio L2 indicó que no hubo transformación. Las imágenes se adquirieron utilizando el sistema de imágenes celulares digitales iRiS™. Este experimento se realizó en dos etapas, cada una con seis repeticiones. Los datos de ambos experimentos se combinaron y se presentaron.
La toxicidad del 5-iodoindol y la avermectina para las semillas se evaluó mediante pruebas de germinación en placas de agar Murashige y Skoog.62 Las semillas de B. oleracea y R. raphanistrum se remojaron primero en agua destilada estéril durante un día, se lavaron con 1 ml de etanol al 100%, se esterilizaron con 1 ml de lejía comercial al 50% (hipoclorito de sodio al 3%) durante 15 min y se lavaron cinco veces con 1 ml de agua estéril. Las semillas esterilizadas se presionaron sobre placas de agar de germinación que contenían 0,86 g/l (0,2X) de medio Murashige y Skoog y 0,7% de agar bacteriológico con o sin 5-iodoindol o avermectina. Las placas se incubaron a 22 °C y se tomaron imágenes después de 3 días de incubación. Este experimento se realizó en dos etapas, cada una de las cuales tuvo seis repeticiones.
Fecha de publicación: 26 de febrero de 2025