Materiales vegetales y patógenos.
El Dr. Pat Brown de la Universidad de Illinois (ahora en UC Davis) proporcionó un mapeo de la población de asociaciones de sorgo conocida como población de conversión de sorgo (SCP). Se ha descrito anteriormente y es una colección de diversas líneas convertidas a fotoperíodo insensible y de menor estatura para facilitar el crecimiento y desarrollo de las plantas en ambientes estadounidenses. En este estudio se utilizaron 510 líneas de esta población, aunque debido a una mala germinación y otros problemas de control de calidad, no todas las líneas se utilizaron en el análisis de los tres rasgos. Finalmente, se utilizaron datos de 345 líneas para el análisis de la respuesta de quitina, 472 líneas para la respuesta flg22 y 456 para la resistencia a TLS.B. cookeiLa cepa LSLP18 se obtuvo del Dr. Burt Bluhm de la Universidad de Arkansas.
Medición de respuesta MAMP
En este estudio se utilizaron dos MAMP diferentes, flg22 (n.º de catálogo Genscript RP19986) y quitina. Las plantas de sorgo se cultivaron en insertos colocados en planos llenos de tierra (33 % de Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) en el invernadero. Las plantas se regaron el día antes de la recolección de la muestra para evitar humedad adicional en las hojas el día de la recolección.
Las líneas fueron aleatorizadas y, por razones logísticas, se sembraron en lotes de 60 líneas. Para cada línea, se plantaron tres 'macetas' con dos semillas por línea. Los lotes posteriores se plantaron tan pronto como se procesó el lote anterior hasta que se evaluó toda la población. Se realizaron dos ejecuciones experimentales para ambos MAMP con genotipos realeatorizados en cada una de las dos ejecuciones.
Los ensayos de ROS se llevaron a cabo como se describió anteriormente. Brevemente, para cada línea se plantaron seis semillas en 3 macetas diferentes. De las plántulas resultantes, se seleccionaron tres basándose en la uniformidad. No se utilizaron plántulas que parecían inusuales o que eran significativamente más altas o más bajas que la mayoría. Se extirparon cuatro discos foliares de 3 mm de diámetro de la parte más ancha de la cuarta hoja de tres plantas diferentes de sorgo de 15 días de edad. Un disco por hoja de dos plantas y dos discos de una planta, siendo el segundo disco el control del agua (ver más abajo). Los discos se hicieron flotar individualmente en 50 µl de H2O en una placa negra de 96 pocillos, se sellaron con un sello de aluminio para evitar la exposición a la luz y se mantuvieron a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente se preparó una solución de reacción usando 2 mg/ml de sonda quimioluminiscente L-012 (Wako, n.° de catálogo 120-04891), 2 mg/ml de peroxidasa de rábano picante (Tipo VI-A, Sigma-Aldrich, n.° de catálogo P6782) y 100 mg/ml de quitina o 2 µM de Flg22. Se añadieron 50 µl de esta solución de reacción a tres de los cuatro pocillos. El cuarto pocillo era un control simulado, al que se añadió la solución de reacción excluyendo el MAMP. También se incluyeron en cada placa cuatro pocillos en blanco que contenían sólo agua.
Después de agregar la solución de reacción, se midió la luminiscencia utilizando el lector de microplacas de detección múltiple SynergyTM 2 (BioTek) cada 2 minutos durante 1 hora. El lector de placas toma medidas de luminiscencia cada 2 minutos durante esta 1 h. Se calculó la suma de las 31 lecturas para dar el valor de cada pocillo. El valor estimado de la respuesta de MAMP para cada genotipo se calculó como (valor de luminiscencia promedio de los tres pocillos experimentales, el valor del pozo simulado), menos el valor promedio del pozo en blanco. Los valores de los pozos en blanco estuvieron consistentemente cerca de cero.
discos de hojas deNicotiana benthamiana, también se incluyeron como controles en cada placa de 96 pocillos una línea de sorgo de alta respuesta (SC0003) y una línea de sorgo de baja respuesta (PI 6069) para fines de control de calidad.
B. cookeipreparación e inoculación del inóculo
B. cookeiEl inóculo se preparó como se describió anteriormente. Brevemente, los granos de sorgo se remojaron en agua durante tres días, se enjuagaron, se colocaron en matraces cónicos de 1 litro y se esterilizaron en autoclave durante una hora a 15 psi y 121 °C. Luego se inocularon los granos con aproximadamente 5 ml de micelio macerado de un cultivo fresco deB. cookeiSe aísla LSLP18 y se deja durante 2 semanas a temperatura ambiente, agitando los matraces cada 3 días. Después de 2 semanas, los granos de sorgo infestados por hongos se secaron al aire y luego se almacenaron a 4 °C hasta la inoculación en el campo. Se utilizó el mismo inóculo durante todo el ensayo y se renovó cada año. Para la inoculación, se colocaron de 6 a 10 granos infestados en el verticilo de plantas de sorgo de 4 a 5 semanas de edad. Las esporas producidas por estos hongos iniciaron la infección en las plantas jóvenes de sorgo en una semana.
Preparación de semillas
Antes de plantar en el campo, la semilla de sorgo se trató con una mezcla de fungicida, insecticida y protector que contenía ~ 1% de fungicida Spirato 480 FS, 4% de fungicida Sebring 480 FS y 3% de protector de semillas Sorpro 940 ES. Luego, las semillas se secaron al aire durante 3 días, lo que proporcionó una fina capa de esta mezcla alrededor de las semillas. El protector permitió el uso del herbicida Dual Magnum como tratamiento de preemergencia.
Evaluación de la resistencia a la mancha foliar objetivo
El SCP se plantó en la Estación Central de Investigación de Cultivos en Clayton, Carolina del Norte, del 14 al 15 de junio de 2017 y el 20 de junio de 2018 en un diseño de bloques completos al azar con dos repeticiones experimentales en cada caso. Los experimentos se plantaron en hileras individuales de 1,8 m con un ancho de hilera de 0,9 m utilizando 10 semillas por parcela. Se plantaron dos hileras fronterizas alrededor de la periferia de cada experimento para evitar efectos de borde. Los experimentos se inocularon el 20 de julio de 2017 y el 20 de julio de 2018, momento en el que las plantas de sorgo estaban en la etapa de crecimiento 3. Las calificaciones se tomaron en escalas de uno a nueve, donde las plantas que no mostraban signos de enfermedad se calificaron como nueve y completamente las plantas muertas se calificaron como una sola. Se tomaron dos calificaciones en 2017 y cuatro lecturas en 2018, dos semanas después de la inoculación de cada año. El sAUDPC (área estandarizada bajo la curva de progresión de la enfermedad) se calculó como se describió anteriormente.
Hora de publicación: 01-abr-2021