Materiales vegetales y patógenos
La población de mapeo de asociación de sorgo, conocida como población de conversión de sorgo (SCP, por sus siglas en inglés), fue proporcionada por el Dr. Pat Brown de la Universidad de Illinois (actualmente en UC Davis). Esta población, descrita previamente, es una colección de líneas diversas convertidas a insensibilidad al fotoperiodo y menor estatura para facilitar el crecimiento y desarrollo de las plantas en los entornos de Estados Unidos. Se utilizaron 510 líneas de esta población en este estudio; sin embargo, debido a problemas de germinación y otros inconvenientes de control de calidad, no todas las líneas se utilizaron en el análisis de los tres caracteres. Finalmente, se utilizaron datos de 345 líneas para el análisis de la respuesta a la quitina, 472 líneas para la respuesta a flg22 y 456 para la resistencia a TLS.B. cookeiLa cepa LSLP18 fue obtenida del Dr. Burt Bluhm en la Universidad de Arkansas.
Medición de la respuesta MAMP
En este estudio se utilizaron dos MAMP diferentes: flg22 (número de catálogo de Genscript RP19986) y quitina. Las plantas de sorgo se cultivaron en insertos colocados sobre bandejas llenas de tierra (33 % de mezcla de cultivo Sunshine Redi-Earth Pro) en el invernadero. Las plantas se regaron el día anterior a la toma de muestras para evitar el exceso de humedad en las hojas el día de la recolección.
Las líneas se seleccionaron aleatoriamente y, por razones logísticas, se plantaron en lotes de 60 líneas. Para cada línea, se plantaron tres macetas con dos semillas por línea. Los lotes subsiguientes se plantaron tan pronto como se procesó el lote anterior hasta que se evaluó toda la población. Se realizaron dos ensayos experimentales para ambos MAMP, con genotipos reasignados aleatoriamente en cada uno de ellos.
Los ensayos de ROS se llevaron a cabo como se describió anteriormente. Brevemente, para cada línea, se plantaron seis semillas en 3 macetas diferentes. De las plántulas resultantes, se seleccionaron tres en función de su uniformidad. Las plántulas que parecían inusuales o que eran significativamente más altas o más bajas que la mayoría no se utilizaron. Se cortaron cuatro discos de hoja de 3 mm de diámetro de la parte más ancha de la cuarta hoja de tres plantas de sorgo diferentes de 15 días de edad. Un disco por hoja de dos plantas y dos discos de una planta, siendo el segundo disco el control de agua (ver más adelante). Los discos se colocaron individualmente flotando en 50 µl de H2O en una placa negra de 96 pocillos, sellada con un sello de aluminio para evitar la exposición a la luz, y se mantuvieron a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente se preparó una solución de reacción con 2 mg/ml de sonda quimioluminiscente L-012 (Wako, catálogo n.° 120-04891), 2 mg/ml de peroxidasa de rábano picante (tipo VI-A, Sigma-Aldrich, catálogo n.° P6782) y 100 mg/ml de quitina o 2 μM de Flg22. Se añadieron 50 µl de esta solución de reacción a tres de los cuatro pocillos. El cuarto pocillo sirvió como control simulado, al que se añadió la solución de reacción sin el MAMP. En cada placa también se incluyeron cuatro pocillos en blanco que contenían únicamente agua.
Tras añadir la solución de reacción, se midió la luminiscencia con el lector de microplacas de detección múltiple Synergy™ 2 (BioTek) cada 2 minutos durante 1 hora. El lector de microplacas realizó mediciones de luminiscencia cada 2 minutos durante este periodo. Se calculó la suma de las 31 lecturas para obtener el valor de cada pocillo. El valor estimado de la respuesta MAMP para cada genotipo se calculó como (valor promedio de luminiscencia de los tres pocillos experimentales - valor del pocillo de control) - menos el valor promedio del pocillo de control. Los valores del pocillo de control fueron consistentemente cercanos a cero.
Discos de hojas deNicotiana benthamianaAdemás, en cada placa de 96 pocillos se incluyeron como controles una línea de sorgo de alta respuesta (SC0003) y una línea de sorgo de baja respuesta (PI 6069) con fines de control de calidad.
B. cookeiPreparación del inóculo e inoculación
B. cookeiEl inóculo se preparó como se describió anteriormente. Brevemente, los granos de sorgo se remojaron en agua durante tres días, se enjuagaron, se colocaron en matraces cónicos de 1 L y se esterilizaron en autoclave durante una hora a 15 psi y 121 °C. Luego, los granos se inocularon con aproximadamente 5 ml de micelio macerado de un cultivo fresco deB. cookeiSe aislaron cepas de LSLP18 y se dejaron reposar durante dos semanas a temperatura ambiente, agitando los frascos cada tres días. Transcurridas dos semanas, los granos de sorgo infestados por el hongo se secaron al aire y se almacenaron a 4 °C hasta su inoculación en campo. Se utilizó el mismo inóculo durante todo el ensayo, el cual se preparó anualmente. Para la inoculación, se colocaron entre 6 y 10 granos infestados en el cogollo de plantas de sorgo de cuatro a cinco semanas de edad. Las esporas producidas por estos hongos iniciaron la infección en las plantas jóvenes de sorgo en el plazo de una semana.
Preparación de semillas
Antes de sembrar, las semillas de sorgo se trataron con una mezcla de fungicida, insecticida y protector que contenía aproximadamente un 1 % de fungicida Spirato 480 FS, un 4 % de fungicida Sebring 480 FS y un 3 % de protector de semillas Sorpro 940 ES. Posteriormente, las semillas se secaron al aire durante 3 días, lo que proporcionó una fina capa de esta mezcla alrededor de las semillas. El protector permitió el uso del herbicida Dual Magnum como tratamiento de preemergencia.
Evaluación de la resistencia a la mancha foliar de Target
El SCP se plantó en la Estación Central de Investigación de Cultivos en Clayton, NC, del 14 al 15 de junio de 2017 y el 20 de junio de 2018 en un diseño de bloques completos aleatorizados con dos repeticiones experimentales en cada caso. Los experimentos se plantaron en hileras simples de 1,8 m con un ancho de hilera de 0,9 m usando 10 semillas por parcela. Se plantaron dos hileras de borde alrededor de la periferia de cada experimento para evitar efectos de borde. Los experimentos se inocularon el 20 de julio de 2017 y el 20 de julio de 2018, momento en el que las plantas de sorgo estaban en la etapa de crecimiento 3. Las calificaciones se tomaron en una escala de uno a nueve, donde las plantas que no mostraban signos de enfermedad se calificaron como nueve y las plantas completamente muertas como uno. Se tomaron dos calificaciones en 2017 y cuatro lecturas en 2018 comenzando dos semanas después de la inoculación cada año. El sAUDPC (área estandarizada bajo la curva de progresión de la enfermedad) se calculó como se describió anteriormente.
Hora de publicación: 01-abr-2021