Materiales vegetales y patógenos
El Dr. Pat Brown, de la Universidad de Illinois (actualmente en UC Davis), proporcionó una población de mapeo de asociaciones de sorgo, conocida como población de conversión de sorgo (SCP). Esta población, descrita previamente, consiste en un conjunto de diversas líneas convertidas a insensibilidad al fotoperiodo y menor estatura para facilitar el crecimiento y desarrollo de las plantas en entornos estadounidenses. En este estudio se utilizaron 510 líneas de esta población, aunque debido a la mala germinación y otros problemas de control de calidad, no todas se incluyeron en el análisis de las tres características. Finalmente, se utilizaron los datos de 345 líneas para el análisis de la respuesta a la quitina, 472 líneas para la respuesta a flg22 y 456 para la resistencia a TLS.B. cookeiLa cepa LSLP18 se obtuvo del Dr. Burt Bluhm de la Universidad de Arkansas.
Medición de la respuesta MAMP
En este estudio se utilizaron dos MAMP diferentes: flg22 (catálogo Genscript n.° RP19986) y quitina. Las plantas de sorgo se cultivaron en injertos colocados en bandejas rellenas de tierra (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) en el invernadero. Las plantas se regaron el día anterior a la recolección de las muestras para evitar un exceso de humedad en las hojas el día de la recolección.
Las líneas se aleatorizaron y, por razones logísticas, se sembraron en lotes de 60 líneas. Para cada línea, se sembraron tres macetas con dos semillas por línea. Los lotes subsiguientes se sembraron tan pronto como se procesó el lote anterior, hasta que se evaluó toda la población. Se realizaron dos experimentos para ambos MAMP, con genotipos realeatorizados en cada uno.
Los ensayos de ROS se llevaron a cabo como se describió previamente. Brevemente, para cada línea, se plantaron seis semillas en tres macetas diferentes. De las plántulas resultantes, se seleccionaron tres con base en la uniformidad. Las plántulas que parecían inusuales o que eran significativamente más altas o más bajas que la mayoría no se utilizaron. Se extirparon cuatro discos foliares de 3 mm de diámetro de la parte más ancha de la cuarta hoja de tres plantas de sorgo diferentes de 15 días de edad. Un disco por hoja de dos plantas y dos discos de una planta, siendo el segundo disco el control de agua (ver más abajo). Los discos se flotaron individualmente en 50 µl de H₂O en una placa negra de 96 pocillos, se sellaron con un sello de aluminio para evitar la exposición a la luz y se mantuvieron a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, se preparó una solución de reacción utilizando 2 mg/ml de sonda quimioluminiscente L-012 (Wako, n.° de catálogo 120-04891), 2 mg/ml de peroxidasa de rábano picante (Tipo VI-A, Sigma-Aldrich, n.° de catálogo P6782) y 100 mg/ml de quitina o 2 μM de Flg22. Se añadieron 50 µl de esta solución de reacción a tres de los cuatro pocillos. El cuarto pocillo fue un control simulado, al que se añadió la solución de reacción sin el MAMP. También se incluyeron cuatro pocillos de blanco con agua en cada placa.
Tras añadir la solución de reacción, se midió la luminiscencia con el lector de microplacas multidetección SynergyTM 2 (BioTek) cada 2 minutos durante 1 hora. El lector de placas toma mediciones de luminiscencia cada 2 minutos durante esta hora. Se calculó la suma de las 31 lecturas para obtener el valor de cada pocillo. El valor estimado de la respuesta a MAMP para cada genotipo se calculó como (valor medio de luminiscencia de los tres pocillos experimentales —valor del pocillo simulado—) menos el valor medio del pocillo en blanco. Los valores del pocillo en blanco se mantuvieron constantemente cercanos a cero.
Discos de hojas deNicotiana benthamianaTambién se incluyeron una línea de sorgo de alta respuesta (SC0003) y una línea de sorgo de baja respuesta (PI 6069) como controles en cada placa de 96 pocillos para fines de control de calidad.
B. cookeipreparación del inóculo e inoculación
B. cookeiEl inóculo se preparó como se describió previamente. Brevemente, los granos de sorgo se remojaron en agua durante tres días, se enjuagaron, se vertieron en matraces cónicos de 1 L y se esterilizaron en autoclave durante una hora a 15 psi y 121 °C. Posteriormente, los granos se inocularon con aproximadamente 5 ml de micelio macerado de un cultivo fresco deB. cookeiLos aislados de LSLP18 se dejaron a temperatura ambiente durante dos semanas, agitando los matraces cada tres días. Después de dos semanas, los granos de sorgo infestados por el hongo se secaron al aire y se almacenaron a 4 °C hasta su inoculación en campo. Se utilizó el mismo inóculo durante todo el ensayo y se renovó anualmente. Para la inoculación, se colocaron de 6 a 10 granos infestados en el verticilo de plantas de sorgo de 4 a 5 semanas de edad. Las esporas producidas por estos hongos iniciaron la infección en las plantas jóvenes de sorgo en una semana.
Preparación de semillas
Antes de sembrar en el campo, las semillas de sorgo se trataron con una mezcla de fungicida, insecticida y protector que contenía aproximadamente 1% de fungicida Spirato 480 FS, 4% de fungicida Sebring 480 FS y 3% de protector de semillas Sorpro 940 ES. Posteriormente, las semillas se secaron al aire durante 3 días, lo que proporcionó una fina capa de esta mezcla alrededor de las semillas. El protector permitió el uso del herbicida Dual Magnum como tratamiento de preemergencia.
Evaluación de la resistencia a la mancha foliar objetivo
El SCP se plantó en la Estación Central de Investigación de Cultivos en Clayton, Carolina del Norte, del 14 al 15 de junio de 2017 y el 20 de junio de 2018 en un diseño de bloques completos aleatorizados con dos réplicas experimentales en cada caso. Los experimentos se sembraron en hileras individuales de 1,8 m con un ancho de hilera de 0,9 m utilizando 10 semillas por parcela. Se plantaron dos hileras de borde alrededor de la periferia de cada experimento para evitar efectos de borde. Los experimentos se inocularon el 20 de julio de 2017 y el 20 de julio de 2018, momento en el que las plantas de sorgo estaban en la etapa de crecimiento 3. Las calificaciones se tomaron en una escala del uno al nueve, donde las plantas que no mostraban signos de enfermedad se calificaron como un nueve y las plantas completamente muertas se calificaron como uno. Se tomaron dos calificaciones en 2017 y cuatro lecturas en 2018 comenzando dos semanas después de la inoculación cada año. El sAUDPC (área estandarizada bajo la curva de progresión de la enfermedad) se calculó como se describió anteriormente.
Hora de publicación: 01-abr-2021