Este estudio evaluó la letalidad, subletalidad y toxicidad de los productos comerciales.cipermetrinaformulaciones a renacuajos de anuros. En la prueba aguda, se probaron concentraciones de 100–800 μg/L durante 96 h. En la prueba crónica, se probaron concentraciones naturales de cipermetrina (1, 3, 6 y 20 μg/L) para la mortalidad, seguidas por pruebas de micronúcleos y anomalías nucleares de glóbulos rojos durante 7 días. La LC50 de la formulación comercial de cipermetrina a renacuajos fue de 273,41 μg L−1. En la prueba crónica, la concentración más alta (20 μg L−1) resultó en más del 50% de mortalidad, ya que mató a la mitad de los renacuajos probados. La prueba de micronúcleos mostró resultados significativos a 6 y 20 μg L−1 y se detectaron varias anomalías nucleares, lo que indica que la formulación comercial de cipermetrina tiene potencial genotóxico contra P. gracilis. La cipermetrina representa un alto riesgo para esta especie, lo que indica que puede causar múltiples problemas y afectar la dinámica de este ecosistema a corto y largo plazo. Por lo tanto, se puede concluir que las formulaciones comerciales de cipermetrina tienen efectos tóxicos sobre P. gracilis.
Debido a la continua expansión de las actividades agrícolas y la aplicación intensiva decontrol de plagasDebido a las medidas de control, los animales acuáticos se exponen frecuentemente a plaguicidas1,2. La contaminación de los recursos hídricos cercanos a los campos agrícolas puede afectar el desarrollo y la supervivencia de organismos no objetivo, como los anfibios.
Los anfibios adquieren cada vez mayor importancia en la evaluación de matrices ambientales. Se consideran buenos bioindicadores de contaminantes ambientales debido a sus características únicas, como ciclos de vida complejos, rápido crecimiento larval, estado trófico, piel permeable10,11, dependencia del agua para la reproducción12 y huevos desprotegidos11,13,14. Se ha demostrado que la ranita de agua (Physalaemus gracilis), comúnmente conocida como ranita llorona, es una especie bioindicadora de contaminación por pesticidas4,5,6,7,15. La especie se encuentra en aguas estancadas, áreas protegidas o áreas con hábitat variable en Argentina, Uruguay, Paraguay y Brasil16,17 y se considera estable según la clasificación de la UICN debido a su amplia distribución y tolerancia a diferentes hábitats18.
Se han reportado efectos subletales en anfibios tras la exposición a la cipermetrina, incluyendo cambios conductuales, morfológicos y bioquímicos en renacuajos23,24,25, alteración de la mortalidad y el tiempo de metamorfosis, cambios enzimáticos, disminución del éxito de eclosión24,25, hiperactividad26, inhibición de la actividad de la colinesterasa27 y cambios en el rendimiento natatorio7,28. Sin embargo, los estudios sobre los efectos genotóxicos de la cipermetrina en anfibios son limitados. Por lo tanto, es importante evaluar la susceptibilidad de las especies de anuros a la cipermetrina.
La contaminación ambiental afecta el crecimiento y desarrollo normal de los anfibios, pero el efecto adverso más grave es el daño genético al ADN causado por la exposición a pesticidas13. El análisis de la morfología de las células sanguíneas es un bioindicador importante de la contaminación y la posible toxicidad de una sustancia para las especies silvestres29. La prueba de micronúcleos es uno de los métodos más utilizados para determinar la genotoxicidad de sustancias químicas en el medio ambiente30. Es un método rápido, eficaz y económico que constituye un buen indicador de la contaminación química de organismos como los anfibios31,32 y puede proporcionar información sobre la exposición a contaminantes genotóxicos33.
El objetivo de este estudio fue evaluar el potencial tóxico de las formulaciones comerciales de cipermetrina para pequeños renacuajos acuáticos utilizando una prueba de micronúcleos y una evaluación de riesgo ecológico.
Mortalidad acumulada (%) de renacuajos de P. gracilis expuestos a diferentes concentraciones de cipermetrina comercial durante el período agudo del ensayo.
Mortalidad acumulada (%) de renacuajos de P. gracilis expuestos a diferentes concentraciones de cipermetrina comercial durante un ensayo crónico.
La alta mortalidad observada fue el resultado de efectos genotóxicos en anfibios expuestos a diferentes concentraciones de cipermetrina (6 y 20 μg/L), como lo demuestra la presencia de micronúcleos (MN) y anormalidades nucleares en eritrocitos. La formación de MN indica errores en la mitosis y está asociada con una mala unión de los cromosomas a los microtúbulos, defectos en los complejos proteicos responsables de la captación y transporte de cromosomas, errores en la segregación cromosómica y errores en la reparación del daño del ADN38,39 y puede estar relacionada con el estrés oxidativo inducido por pesticidas40,41. Se observaron otras anormalidades en todas las concentraciones evaluadas. El aumento de las concentraciones de cipermetrina aumentó las anormalidades nucleares en los eritrocitos en un 5% y un 20% en las dosis más bajas (1 μg/L) y más altas (20 μg/L), respectivamente. Por ejemplo, los cambios en el ADN de una especie pueden tener graves consecuencias para la supervivencia a corto y largo plazo, resultando en la disminución de la población, alteración de la aptitud reproductiva, endogamia, pérdida de diversidad genética y alteraciones en las tasas de migración. Todos estos factores pueden afectar la supervivencia y el mantenimiento de las especies42,43. La formación de anomalías eritroides puede indicar un bloqueo en la citocinesis, lo que resulta en una división celular anormal (eritrocitos binucleados)44,45; los núcleos multilobulados son protuberancias de la membrana nuclear con múltiples lóbulos46, mientras que otras anomalías eritroides pueden estar asociadas con la amplificación del ADN, como los riñones/blebs nucleares47. La presencia de eritrocitos anucleados puede indicar un transporte de oxígeno deficiente, especialmente en agua contaminada48,49. La apoptosis indica muerte celular50.
Otros estudios también han demostrado los efectos genotóxicos de la cipermetrina. Kabaña et al.51 demostraron la presencia de micronúcleos y cambios nucleares, como células binucleadas y apoptóticas, en células de Odontophrynus americanus tras la exposición a altas concentraciones de cipermetrina (5000 y 10 000 μg L−1) durante 96 h. También se detectó apoptosis inducida por cipermetrina en P. biligonigerus52 y Rhinella arenarum53. Estos resultados sugieren que la cipermetrina tiene efectos genotóxicos en diversos organismos acuáticos y que el ensayo de MN y ENA podría ser un indicador de efectos subletales en anfibios, además de ser aplicable a especies nativas y poblaciones silvestres expuestas a tóxicos12.
Las formulaciones comerciales de cipermetrina representan un alto riesgo ambiental (tanto agudo como crónico), con HQ que exceden el nivel de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA)54 que puede afectar negativamente a las especies si está presente en el ambiente. En la evaluación de riesgo crónico, el NOEC para mortalidad fue de 3 μg L−1, confirmando que las concentraciones encontradas en el agua pueden representar un riesgo para la especie55. El NOEC letal para larvas de R. arenarum expuestas a una mezcla de endosulfán y cipermetrina fue de 500 μg L−1 después de 168 h; este valor disminuyó a 0,0005 μg L−1 después de 336 h. Los autores muestran que cuanto más prolongada es la exposición, menores son las concentraciones que son dañinas para la especie. También es importante destacar que los valores de NOEC fueron más altos que los de P. gracilis en el mismo tiempo de exposición, lo que indica que la respuesta de la especie a la cipermetrina es específica de la especie. Además, en términos de mortalidad, el valor de CHQ de P. gracilis tras la exposición a cipermetrina alcanzó 64,67, superior al valor de referencia establecido por la Agencia de Protección Ambiental de EE. UU. (EPA)54, y el valor de CHQ de las larvas de R. arenarum también fue superior a este valor (CHQ > 388,00 tras 336 h), lo que indica que los insecticidas estudiados representan un alto riesgo para varias especies de anfibios. Considerando que P. gracilis requiere aproximadamente 30 días para completar la metamorfosis56, se puede concluir que las concentraciones de cipermetrina estudiadas podrían contribuir a la disminución de la población al impedir que los individuos infectados alcancen la etapa adulta o reproductiva a una edad temprana.
En la evaluación del riesgo calculado de micronúcleos y otras anomalías nucleares de eritrocitos, los valores de CHQ oscilaron entre 14,92 y 97,00, lo que indica que la cipermetrina presentaba un riesgo genotóxico potencial para P. gracilis incluso en su hábitat natural. Considerando la mortalidad, la concentración máxima de compuestos xenobióticos tolerable para P. gracilis fue de 4,24 μg L−1. Sin embargo, concentraciones tan bajas como 1 μg/L también mostraron efectos genotóxicos. Este hecho podría provocar un aumento en el número de individuos anormales57 y afectar el desarrollo y la reproducción de las especies en sus hábitats, lo que conllevaría una disminución de las poblaciones de anfibios.
Las formulaciones comerciales del insecticida cipermetrina mostraron una alta toxicidad aguda y crónica para P. gracilis. Se observaron mayores tasas de mortalidad, probablemente debido a los efectos tóxicos, como lo demuestra la presencia de micronúcleos y anomalías nucleares de eritrocitos, especialmente núcleos serrados, núcleos lobulados y núcleos vesiculares. Además, las especies estudiadas mostraron mayores riesgos ambientales, tanto agudos como crónicos. Estos datos, combinados con estudios previos de nuestro grupo de investigación, mostraron que incluso diferentes formulaciones comerciales de cipermetrina aún causaron una disminución de las actividades de la acetilcolinesterasa (AChE) y la butirilcolinesterasa (BChE) y estrés oxidativo58, y resultaron en cambios en la actividad de natación y malformaciones orales59 en P. gracilis, lo que indica que las formulaciones comerciales de cipermetrina tienen una alta toxicidad letal y subletal para esta especie. Hartmann et al. 60 encontraron que las formulaciones comerciales de cipermetrina fueron las más tóxicas para P. gracilis y otra especie del mismo género (P. cuvieri), en comparación con otros nueve pesticidas. Esto sugiere que las concentraciones de cipermetrina legalmente aprobadas para la protección ambiental podrían resultar en una alta mortalidad y una disminución de la población a largo plazo.
Se requieren más estudios para evaluar la toxicidad del pesticida en anfibios, ya que las concentraciones presentes en el ambiente pueden causar una alta mortalidad y representar un riesgo potencial para P. gracilis. Se debe fomentar la investigación sobre especies de anfibios, ya que los datos sobre estos organismos son escasos, en particular sobre las especies brasileñas.
El ensayo de toxicidad crónica tuvo una duración de 168 h (7 días) en condiciones estáticas y las concentraciones subletales fueron: 1, 3, 6 y 20 μg ia L−1. En ambos experimentos, se evaluaron 10 renacuajos por grupo de tratamiento con seis réplicas, para un total de 60 renacuajos por concentración. Mientras tanto, el tratamiento con solo agua sirvió como control negativo. Cada configuración experimental consistió en una placa de vidrio estéril con una capacidad de 500 ml y una densidad de 1 renacuajo por 50 ml de solución. El matraz se cubrió con una película de polietileno para evitar la evaporación y se aireó continuamente.
El agua se analizó químicamente para determinar las concentraciones de pesticidas a las 0, 96 y 168 h. Según Sabin et al. 68 y Martins et al. 69, los análisis se realizaron en el Laboratorio de Análisis de Pesticidas (LARP) de la Universidad Federal de Santa María mediante cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de triple cuadrupolo (Varian modelo 1200, Palo Alto, California, EE. UU.). La determinación cuantitativa de pesticidas en agua se muestra como material suplementario (Tabla SM1).
Para la prueba de micronúcleos (MNT) y la prueba de anomalía nuclear de eritrocitos (ARN), se analizaron 15 renacuajos de cada grupo de tratamiento. Los renacuajos se anestesiaron con lidocaína al 5% (50 mg g-170) y se obtuvieron muestras de sangre mediante punción cardíaca con jeringas desechables heparinizadas. Se prepararon frotis de sangre en portaobjetos estériles, se secaron al aire, se fijaron con metanol al 100% (4 °C) durante 2 minutos y, a continuación, se tiñeron con solución de Giemsa al 10% durante 15 minutos en oscuridad. Al finalizar el proceso, los portaobjetos se lavaron con agua destilada para eliminar el exceso de colorante y se secaron a temperatura ambiente.
Al menos 1000 glóbulos rojos de cada renacuajo se analizaron utilizando un microscopio de 100× con un objetivo 71 para determinar la presencia de MN y ENA. Se evaluó un total de 75.796 glóbulos rojos de renacuajos considerando las concentraciones de cipermetrina y los controles. La genotoxicidad se analizó según el método de Carrasco et al. y Fenech et al.38,72 determinando la frecuencia de las siguientes lesiones nucleares: (1) células anucleadas: células sin núcleo; (2) células apoptóticas: fragmentación nuclear, muerte celular programada; (3) células binucleadas: células con dos núcleos; (4) brotes nucleares o células bleb: células con núcleos con pequeñas protrusiones de la membrana nuclear, blebs similares en tamaño a micronúcleos; (5) células cariolisadas: células con solo el contorno del núcleo sin material interno; (6) células con muescas: células con núcleos con grietas o muescas evidentes, también llamados núcleos arriñonados; (7) células lobuladas: células con protuberancias nucleares más grandes que las vesículas mencionadas; y (8) microcélulas: células con núcleos condensados y citoplasma reducido. Los cambios se compararon con los resultados del control negativo.
Los resultados de la prueba de toxicidad aguda (CL50) se analizaron con el software GBasic y el método TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Los datos de la prueba crónica se sometieron a una prueba previa de normalidad de errores (Shapiro-Wilks) y homogeneidad de varianza (Bartlett). Los resultados se analizaron mediante un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional. Se utilizó la prueba de Tukey para comparar los datos entre sí, y la prueba de Dunnett para comparar los datos del grupo de tratamiento con el grupo control negativo.
Los datos de LOEC y NOEC se analizaron mediante la prueba de Dunnett. Las pruebas estadísticas se realizaron con el programa Statistica 8.0 (StatSoft) con un nivel de significancia del 95 % (p < 0,05).
Hora de publicación: 13 de marzo de 2025