La fosforilación activa el regulador de crecimiento maestro DELLA en Arabidopsis al promover la asociación de la histona H2A con la cromatina.

Las proteínas DELLA son maestras conservadasreguladores del crecimientoque desempeñan un papel central en el control del desarrollo de las plantas en respuesta a señales internas y ambientales. DELLA actúa como un regulador transcripcional y es reclutado a promotores diana mediante la unión a factores de transcripción (FT) e histona H2A a través de su dominio GRAS. Estudios recientes han demostrado que la estabilidad de DELLA está regulada postraduccionalmente a través de dos mecanismos: la poliubiquitinación inducida por la fitohormona giberelina, que conduce a su rápida degradación, y la conjugación de modificadores pequeños similares a la ubiquitina (SUMO) para aumentar su acumulación. Además, la actividad de DELLA está regulada dinámicamente por dos glicosilaciones diferentes: la interacción DELLA-FT se ve potenciada por la O-fucosilación, pero inhibida por la modificación de O-GlcNAc (N-acetilglucosamina unida a O). Sin embargo, el papel de la fosforilación de DELLA sigue sin estar claro, ya que estudios previos han mostrado resultados contradictorios, desde aquellos que muestran que la fosforilación promueve o reduce la degradación de DELLA hasta otros que muestran que la fosforilación no afecta su estabilidad. Aquí identificamos sitios de fosforilación en REPRESSOR.ga1-3Se purificó el gen RGA (AtDELLA) de Arabidopsis thaliana mediante análisis de espectrometría de masas y se demostró que la fosforilación de dos péptidos RGA en las regiones PolyS y PolyS/T promueve la unión a H2A y potencia la actividad de RGA. Se observó la asociación de RGA con promotores diana. Cabe destacar que la fosforilación no afecta las interacciones RGA-TF ni la estabilidad de RGA. Nuestro estudio revela el mecanismo molecular mediante el cual la fosforilación induce la actividad de DELLA.
Para dilucidar el papel de la fosforilación en la regulación de la función de DELLA, es fundamental identificar los sitios de fosforilación de DELLA in vivo y realizar análisis funcionales en plantas. Mediante purificación por afinidad de extractos vegetales seguida de análisis MS/MS, identificamos varios sitios de fosforilación en RGA. En condiciones de deficiencia de GA, la fosforilación de RHA aumenta, pero no afecta su estabilidad. Es importante destacar que los ensayos de co-IP y ChIP-qPCR revelaron que la fosforilación en la región PolyS/T de RGA promueve su interacción con H2A y su asociación con promotores diana, lo que revela el mecanismo por el cual la fosforilación induce la función de RGA.
RGA se recluta a la cromatina diana mediante la interacción del subdominio LHR1 con TF y luego se une a H2A a través de su región PolyS/T y el subdominio PFYRE, formando el complejo H2A-RGA-TF para estabilizar RGA. La fosforilación de Pep 2 en la región PolyS/T entre el dominio DELLA y el dominio GRAS por una quinasa no identificada potencia la unión RGA-H2A. La proteína mutante rgam2A anula la fosforilación de RGA y adopta una conformación proteica diferente que interfiere con la unión a H2A. Esto resulta en la desestabilización de las interacciones transitorias TF-rgam2A y la disociación de rgam2A de la cromatina diana. Esta figura muestra únicamente la represión transcripcional mediada por RGA. Podría describirse un patrón similar para la activación transcripcional mediada por RGA, con la salvedad de que el complejo H2A-RGA-TF promovería la transcripción del gen diana y la desfosforilación de rgam2A disminuiría la transcripción. Figura modificada de Huang et al.21.
Todos los datos cuantitativos se analizaron estadísticamente con Excel, y las diferencias significativas se determinaron mediante la prueba t de Student. No se utilizaron métodos estadísticos para determinar preliminarmente el tamaño de la muestra. No se excluyó ningún dato del análisis; el experimento no fue aleatorio; los investigadores no desconocían la distribución de los datos durante el experimento ni la evaluación de los resultados. El tamaño de la muestra se indica en la leyenda de la figura y en el archivo de datos original.
Para obtener más información sobre el diseño del estudio, consulte el resumen del Informe de Portafolio Natural asociado a este artículo.
Los datos de proteómica por espectrometría de masas se han aportado al consorcio ProteomeXchange a través del repositorio asociado PRIDE66 con el identificador de conjunto de datos PXD046004. Todos los demás datos obtenidos durante este estudio se presentan en la Información complementaria, los Archivos de datos complementarios y los Archivos de datos brutos. Los datos originales se proporcionan para este artículo.