Las proteínas DELLA se conservanreguladores del crecimientoque desempeñan un papel fundamental en el desarrollo vegetal en respuesta a señales internas y externas. Como reguladores transcripcionales, las DELLA se unen a factores de transcripción (FT) y a la histona H2A a través de sus dominios GRAS y son reclutadas para actuar sobre los promotores. Estudios recientes han demostrado que la estabilidad de las DELLA se regula postraduccionalmente mediante dos mecanismos: la poliubiquitinación inducida por la fitohormona.giberelina, lo que conduce a su rápida degradación, y la conjugación con un pequeño modificador similar a la ubiquitina (SUMO), que aumenta su acumulación. Además, la actividad de DELLA está regulada dinámicamente por dos mecanismos de glicosilación distintos: la O-fucosilación mejora la interacción DELLA-TF, mientras que la modificación de N-acetilglucosamina O-ligada (O-GlcNAc) inhibe la interacción DELLA-TF. Sin embargo, el papel de la fosforilación de DELLA no está claro ya que estudios previos han mostrado resultados contradictorios, con algunos sugiriendo que la fosforilación promueve o reprime la degradación de DELLA y otros sugiriendo que la fosforilación no afecta su estabilidad. Aquí, identificamos sitios de fosforilación en el represor GA1-3 (RGA), AtDELLA, purificado de Arabidopsis thaliana por espectrometría de masas y mostramos que la fosforilación de dos péptidos RGA en las regiones PolyS y PolyS/T mejora la actividad de RGA al promover la unión de H2A y la asociación de RGA con promotores diana. Cabe destacar que la fosforilación no afectó las interacciones RGA-TF ni la estabilidad de RGA. Nuestro estudio revela un mecanismo molecular por el cual la fosforilación induce la actividad de DELLA.
Nuestro análisis espectrométrico de masas reveló que tanto Pep1 como Pep2 presentaban una alta fosforilación en RGA en el contexto de Ga1 deficiente en GA. Además de este estudio, estudios fosfoproteómicos también han revelado la fosforilación de Pep1 en RGA, aunque su función aún no se ha estudiado53,54,55. Por el contrario, la fosforilación de Pep2 no se había descrito previamente, ya que este péptido solo pudo detectarse mediante el transgén RGAGKG. Si bien la mutación m1A, que anuló la fosforilación de Pep1, solo redujo ligeramente la actividad de RGA en planta, tuvo un efecto aditivo al combinarse con m2A en la reducción de la actividad de RGA (Figura Suplementaria 6). Cabe destacar que la fosforilación de Pep1 se redujo significativamente en el mutante sly1 potenciado con GA en comparación con ga1, lo que sugiere que GA promueve la desfosforilación de RGA, reduciendo su actividad. El mecanismo por el cual GA suprime la fosforilación de RGA requiere mayor investigación. Una posibilidad es que esto se logre mediante la regulación de una proteína quinasa no identificada. Aunque los estudios han demostrado que la expresión de la proteína quinasa EL1 de CK1 es regulada negativamente por GA en arroz41, nuestros resultados indican que las mutaciones de orden superior del homólogo EL1 de Arabidopsis (AEL1-4) no reducen la fosforilación de RGA. De acuerdo con nuestros resultados, un estudio fosfoproteómico reciente utilizando líneas que sobreexpresan AEL de Arabidopsis y un mutante triple ael no identificó ninguna proteína DELLA como sustrato de estas quinasas56. Cuando preparamos el manuscrito, se informó que GSK3, el gen que codifica una quinasa similar a GSK3/SHAGGY en trigo (Triticum aestivum), puede fosforilar DELLA (Rht-B1b)57, aunque la fosforilación de Rht-B1b por GSK3 no se ha confirmado in planta. Las reacciones enzimáticas in vitro en presencia de GSK3, seguidas de un análisis por espectrometría de masas, revelaron tres sitios de fosforilación ubicados entre los dominios DELLA y GRAS de Rht-B1b (Fig. 3 del Suplemento). Las sustituciones de serina por alanina en los tres sitios de fosforilación resultaron en una disminución de la actividad de Rht-B1b en el trigo transgénico, lo cual concuerda con nuestros hallazgos de que las sustituciones de alanina en Pep2 RGA disminuyeron la actividad de RGA. Sin embargo, los ensayos de degradación de proteínas in vitro demostraron además que la fosforilación también puede estabilizar Rht-B1b57. Esto contrasta con nuestros resultados, que indican que las sustituciones de alanina en Pep2 RGA no alteran su estabilidad in planta. La GSK3 en el trigo es un ortólogo de la proteína 2 insensible a brasinoesteroides (BIN2) en Arabidopsis 57. BIN2 es un regulador negativo de la señalización de BR, y BR activa su vía de señalización al causar la degradación de BIN2 58. Demostramos que el tratamiento con BR no reduce la estabilidad de RGA 59 ni los niveles de fosforilación en Arabidopsis (Figura complementaria 2), lo que sugiere que es poco probable que RGA sea fosforilada por BIN2.
Todos los datos cuantitativos se analizaron estadísticamente con Excel y las diferencias significativas se determinaron mediante la prueba t de Student. No se emplearon métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyó ningún dato del análisis; el experimento no fue aleatorizado; y los investigadores conocieron la asignación durante el experimento y la evaluación de resultados. Los tamaños de muestra se proporcionan en las leyendas de las figuras y en los archivos de datos sin procesar.
Hora de publicación: 15 de abril de 2025