El crecimiento del meristemo apical del tallo (SAM) es fundamental para la arquitectura del tallo. Hormonas vegetalesgiberelinasLas giberelinas (GA) desempeñan funciones clave en la coordinación del crecimiento vegetal, pero su papel en el meristemo apical del tallo (SAM) aún no se comprende completamente. En este trabajo, desarrollamos un biosensor ratiométrico de la señalización de GA mediante la ingeniería de la proteína DELLA para suprimir su función reguladora esencial en la respuesta transcripcional a las GA, preservando al mismo tiempo su degradación tras el reconocimiento de las mismas. Demostramos que este biosensor basado en la degradación registra con precisión los cambios en los niveles de GA y la detección celular durante el desarrollo. Utilizamos este biosensor para mapear la actividad de señalización de GA en el SAM. Mostramos que las señales altas de GA se presentan predominantemente en células ubicadas entre primordios de órganos, que son precursores de las células de los entrenudos. Mediante enfoques de ganancia y pérdida de función, demostramos además que las GA regulan la orientación del plano de división celular, estableciendo la organización celular canónica de los entrenudos y, por lo tanto, promoviendo la especificación de los entrenudos en el SAM.
El meristemo apical del tallo (SAM), ubicado en el ápice del tallo, contiene un nicho de células madre cuya actividad genera órganos laterales y nudos del tallo de manera modular e iterativa a lo largo de la vida de la planta. Cada una de estas unidades repetitivas, o nudos de la planta, incluye entrenudos y órganos laterales en los nudos, y meristemos axilares en las axilas de las hojas1. El crecimiento y la organización de los nudos de la planta cambian durante el desarrollo. En Arabidopsis, el crecimiento internodal se suprime durante la etapa vegetativa, y los meristemos axilares permanecen latentes en las axilas de las hojas de roseta. Durante la transición a la fase floral, el SAM se convierte en el meristemo de la inflorescencia, generando entrenudos alargados y yemas axilares, ramitas en las axilas de las hojas caulinares y, posteriormente, flores sin hojas2. Aunque hemos avanzado significativamente en la comprensión de los mecanismos que controlan la iniciación de hojas, flores y ramas, se sabe relativamente poco sobre cómo surgen los entrenudos.
Comprender la distribución espaciotemporal de las GA ayudará a entender mejor las funciones de estas hormonas en diferentes tejidos y en diferentes etapas de desarrollo. La visualización de la degradación de la fusión RGA-GFP expresada bajo la acción de su propio promotor proporciona información importante sobre la regulación de los niveles totales de GA en las raíces15,16. Sin embargo, la expresión de RGA varía entre los tejidos17 y está regulada por GA18. Por lo tanto, la expresión diferencial del promotor de RGA puede resultar en el patrón de fluorescencia observado con RGA-GFP y, por lo tanto, este método no es cuantitativo. Más recientemente, la GA marcada con fluoresceína (Fl) bioactiva19,20 reveló la acumulación de GA en la endocorteza de la raíz y la regulación de sus niveles celulares por el transporte de GA. Recientemente, el sensor FRET de GA nlsGPS1 mostró que los niveles de GA se correlacionan con la elongación celular en raíces, filamentos e hipocótilos cultivados en la oscuridad21. Sin embargo, como hemos visto, la concentración de GA no es el único parámetro que controla la actividad de señalización de GA, ya que depende de procesos de detección complejos. En este trabajo, basándonos en nuestro conocimiento de las vías de señalización DELLA y GA, presentamos el desarrollo y la caracterización de un biosensor ratiométrico basado en la degradación para la señalización de GA. Para desarrollar este biosensor cuantitativo, utilizamos una RGA mutante sensible a GA fusionada a una proteína fluorescente y expresada ubicuamente en los tejidos, así como una proteína fluorescente insensible a GA. Demostramos que las fusiones de la proteína RGA mutante no interfieren con la señalización endógena de GA cuando se expresan ubicuamente, y que este biosensor puede cuantificar la actividad de señalización resultante tanto de la entrada de GA como del procesamiento de la señal de GA por el aparato de detección con alta resolución espaciotemporal. Utilizamos este biosensor para mapear la distribución espaciotemporal de la actividad de señalización de GA y cuantificar cómo GA regula el comportamiento celular en la epidermis SAM. Demostramos que GA regula la orientación del plano de división de las células SAM ubicadas entre los primordios de los órganos, definiendo así la organización celular canónica del internodo.
Finalmente, nos preguntamos si qmRGA podría informar sobre cambios en los niveles endógenos de GA utilizando hipocotilos en crecimiento. Previamente demostramos que el nitrato estimula el crecimiento al aumentar la síntesis de GA y, a su vez, la degradación de DELLA34. En consecuencia, observamos que la longitud del hipocotilo en plántulas pUBQ10::qmRGA cultivadas con un suministro abundante de nitrato (10 mM NO3−) fue significativamente mayor que la de las plántulas cultivadas en condiciones deficientes en nitrato (Figura suplementaria 6a). De acuerdo con la respuesta de crecimiento, las señales de GA fueron más altas en los hipocotilos de las plántulas cultivadas en condiciones de 10 mM NO3− que en las plántulas cultivadas en ausencia de nitrato (Figura suplementaria 6b, c). Por lo tanto, qmRGA también permite monitorear los cambios en la señalización de GA inducidos por cambios endógenos en la concentración de GA.
Para comprender si la actividad de señalización de GA detectada por qmRGA depende de la concentración de GA y la percepción de GA, como se esperaba según el diseño del sensor, analizamos la expresión de los tres receptores GID1 en tejidos vegetativos y reproductivos. En plántulas, la línea reportera GID1-GUS mostró que GID1a y c se expresaban en altos niveles en los cotiledones (Fig. 3a–c). Además, los tres receptores se expresaron en hojas, primordios de raíces laterales, ápices de raíces (excepto en la caliptra de GID1b) y el sistema vascular (Fig. 3a–c). En el meristemo apical del tallo (SAM) de la inflorescencia, detectamos señales GUS solo para GID1b y 1c (Fig. suplementaria 7a–c). La hibridación in situ confirmó estos patrones de expresión y demostró además que GID1c se expresaba uniformemente a bajos niveles en el SAM, mientras que GID1b mostraba una mayor expresión en la periferia del SAM (Fig. suplementaria 7d–l). La fusión traslacional pGID1b::2xmTQ2-GID1b también reveló un rango gradual de expresión de GID1b, desde una expresión baja o nula en el centro del SAM hasta una alta expresión en los bordes del órgano (Fig. suplementaria 7m). Por lo tanto, los receptores GID1 no están distribuidos uniformemente a través y dentro de los tejidos. En experimentos posteriores, también observamos que la sobreexpresión de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) aumentó la sensibilidad de qmRGA en hipocótilos a la aplicación externa de GA (Fig. 3d, e). Por el contrario, la fluorescencia medida por qd17mRGA en el hipocótilo fue insensible al tratamiento con GA3 (Fig. 3f, g). Para ambos ensayos, las plántulas fueron tratadas con altas concentraciones de GA (100 μM GA3) para evaluar el comportamiento rápido del sensor, donde la capacidad de unirse al receptor GID1 se incrementó o se perdió. En conjunto, estos resultados confirman que el biosensor qmRGA cumple una función combinada como sensor de GA y GA, y sugieren que la expresión diferencial del receptor GID1 puede modular significativamente la emisividad del sensor.
Hasta la fecha, la distribución de las señales de GA en el SAM sigue sin estar clara. Por lo tanto, utilizamos plantas que expresan qmRGA y el reportero de células madre pCLV3::mCherry-NLS35 para calcular mapas cuantitativos de alta resolución de la actividad de señalización de GA, centrándonos en la capa L1 (epidermis; Fig. 4a, b, ver Métodos y Métodos suplementarios), ya que L1 juega un papel clave en el control del crecimiento del SAM36. Aquí, la expresión de pCLV3::mCherry-NLS proporcionó un punto de referencia geométrico fijo para analizar la distribución espaciotemporal de la actividad de señalización de GA37. Aunque se considera que GA es esencial para el desarrollo de los órganos laterales4, observamos que las señales de GA eran bajas en el primordio floral (P) a partir de la etapa P3 (Fig. 4a, b), mientras que los primordios jóvenes P1 y P2 tenían una actividad moderada similar a la de la región central (Fig. 4a, b). Se detectó una mayor actividad de señalización de GA en los límites del primordio del órgano, comenzando en P1/P2 (en los lados del límite) y alcanzando su máximo en P4, así como en todas las células de la región periférica ubicada entre los primordios (Fig. 4a, b y Fig. suplementaria 8a, b). Esta mayor actividad de señalización de GA se observó no solo en la epidermis sino también en las capas L2 y L3 superior (Fig. suplementaria 8b). El patrón de señales de GA detectado en el SAM usando qmRGA también se mantuvo sin cambios a lo largo del tiempo (Fig. suplementaria 8c–f, k). Aunque el constructo qd17mRGA se reguló negativamente de forma sistemática en el SAM de plantas T3 de cinco líneas independientes que caracterizamos en detalle, pudimos analizar los patrones de fluorescencia obtenidos con el constructo pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. suplementaria 8g–j, l). En esta línea de control, solo se detectaron cambios menores en la relación de fluorescencia en el SAM, pero en el centro del SAM observamos una disminución clara e inesperada de VENUS asociada con TagBFP. Esto confirma que el patrón de señalización observado por qmRGA refleja la degradación dependiente de GA de mRGA-VENUS, pero también demuestra que qmRGA puede sobreestimar la actividad de señalización de GA en el centro del meristemo. En resumen, nuestros resultados revelan un patrón de señalización de GA que refleja principalmente la distribución de los primordios. Esta distribución de la región interprimordial (IPR) se debe al establecimiento gradual de una alta actividad de señalización de GA entre el primordio en desarrollo y la región central, mientras que, al mismo tiempo, la actividad de señalización de GA en el primordio disminuye (Fig. 4c, d).
La distribución de los receptores GID1b y GID1c (ver arriba) sugiere que la expresión diferencial de los receptores de GA ayuda a configurar el patrón de actividad de señalización de GA en el SAM. Nos preguntamos si la acumulación diferencial de GA podría estar involucrada. Para investigar esta posibilidad, utilizamos el sensor FRET de GA nlsGPS121. Se detectó una mayor frecuencia de activación en el SAM de nlsGPS1 tratado con 10 μM de GA4+7 durante 100 min (Fig. suplementaria 9a–e), lo que indica que nlsGPS1 responde a los cambios en la concentración de GA en el SAM, como lo hace en las raíces21. La distribución espacial de la frecuencia de activación de nlsGPS1 reveló niveles relativamente bajos de GA en las capas externas del SAM, pero mostró que estaban elevados en el centro y en los bordes del SAM (Fig. 4e y Fig. suplementaria 9a,c). Esto sugiere que la GA también se distribuye en el SAM con un patrón espacial comparable al revelado por qmRGA. Como enfoque complementario, también tratamos el SAM con GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl solo como control negativo. La señal de Fl se distribuyó por todo el SAM, incluyendo la región central y el primordio, aunque con menor intensidad (Fig. 4j y Fig. suplementaria 10d). En contraste, los tres GA-Fl se acumularon específicamente dentro de los bordes del primordio y en diferentes grados en el resto del IPR, con GA7-Fl acumulándose en el dominio más grande del IPR (Fig. 4k y Fig. suplementaria 10a,b). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia reveló que la relación de intensidad IPR/no IPR fue mayor en el SAM tratado con GA-Fl en comparación con el SAM tratado con Fl (Fig. 4l y Fig. suplementaria 10c). En conjunto, estos resultados sugieren que GA está presente en concentraciones más altas en las células del IPR que se encuentran más cerca del borde del órgano. Esto sugiere que el patrón de actividad de señalización de GA en el meristemo apical del tallo (SAM) resulta tanto de la expresión diferencial de receptores de GA como de la acumulación diferencial de GA en las células del IPR cerca de los bordes del órgano. Por lo tanto, nuestro análisis reveló un patrón espaciotemporal inesperado de señalización de GA, con menor actividad en el centro y el primordio del SAM y mayor actividad en el IPR en la región periférica.
Para comprender el papel de la actividad de señalización diferencial de GA en el SAM, analizamos la correlación entre la actividad de señalización de GA, la expansión celular y la división celular utilizando imágenes de lapso de tiempo en tiempo real del SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Dado el papel de GA en la regulación del crecimiento, se esperaba una correlación positiva con los parámetros de expansión celular. Por lo tanto, primero comparamos los mapas de actividad de señalización de GA con mapas de tasa de crecimiento de la superficie celular (como un aproximante de la fuerza de expansión celular para una célula dada y para células hijas en división) y con mapas de anisotropía de crecimiento, que mide la direccionalidad de la expansión celular (también utilizado aquí para una célula dada y para células hijas en división; Fig. 5a,b, ver Métodos y Métodos suplementarios). Nuestros mapas de tasa de crecimiento de la superficie celular del SAM son consistentes con observaciones previas38,39, con tasas de crecimiento mínimas en el borde y tasas de crecimiento máximas en flores en desarrollo (Fig. 5a). El análisis de componentes principales (PCA) mostró que la actividad de señalización de GA estaba correlacionada negativamente con la intensidad de crecimiento de la superficie celular (Figura 5c). También demostramos que los ejes principales de variación, incluyendo la entrada de señalización de GA y la intensidad de crecimiento, eran ortogonales a la dirección determinada por la alta expresión de CLV3, lo que confirma la exclusión de células del centro SAM en los análisis restantes. El análisis de correlación de Spearman confirmó los resultados del PCA (Figura 5d), lo que indica que señales de GA más altas en el IPR no resultaron en una mayor expansión celular. Sin embargo, el análisis de correlación reveló una ligera correlación positiva entre la actividad de señalización de GA y la anisotropía del crecimiento (Figura 5c, d), lo que sugiere que una mayor señalización de GA en el IPR influye en la dirección del crecimiento celular y posiblemente en la posición del plano de división celular.
a, b Mapas de calor del crecimiento superficial medio (a) y anisotropía del crecimiento (b) en SAM promediados en siete plantas independientes (utilizados como aproximaciones de la fuerza y dirección de la expansión celular, respectivamente). c El análisis PCA incluyó las siguientes variables: señal de GA, intensidad del crecimiento superficial, anisotropía del crecimiento superficial y expresión de CLV3. El componente 1 del PCA se correlacionó principalmente negativamente con la intensidad del crecimiento superficial y positivamente con la señal de GA. El componente 2 del PCA se correlacionó principalmente positivamente con la anisotropía del crecimiento superficial y negativamente con la expresión de CLV3. Los porcentajes representan la variación explicada por cada componente. d Análisis de correlación de Spearman entre la señal de GA, la intensidad del crecimiento superficial y la anisotropía del crecimiento superficial a escala tisular excluyendo CZ. El número a la derecha es el valor rho de Spearman entre dos variables. Los asteriscos indican casos donde la correlación/correlación negativa es altamente significativa. e Visualización 3D de células L1 de SAM de Col-0 mediante microscopía confocal. Las nuevas paredes celulares formadas en el SAM (pero no en el primordio) a las 10 h están coloreadas según sus valores angulares. La barra de color se muestra en la esquina inferior derecha. El recuadro muestra la imagen 3D correspondiente a las 0 h. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. f Los diagramas de caja muestran las tasas de división celular en el SAM Col-0 IPR y no IPR (n = 10 plantas independientes). La línea central muestra la mediana y los límites de la caja indican los percentiles 25 y 75. Los bigotes indican los valores mínimo y máximo determinados con el software R. Los valores p se obtuvieron con la prueba t de Welch de dos colas. g, h Diagrama esquemático que muestra (g) cómo medir el ángulo de la nueva pared celular (magenta) con respecto a la dirección radial desde el centro del SAM (línea punteada blanca) (solo se consideran valores de ángulo agudo, es decir, 0–90°), y (h) las direcciones circunferencial/lateral y radial dentro del meristemo. i Histogramas de frecuencia de la orientación del plano de división celular a través del SAM (azul oscuro), IPR (azul medio) y no-IPR (azul claro), respectivamente. Los valores de p se obtuvieron mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos colas. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. j Histogramas de frecuencia de la orientación del plano de división celular del IPR alrededor de P3 (verde claro), P4 (verde medio) y P5 (verde oscuro), respectivamente. Los valores de p se obtuvieron mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos colas. El experimento se repitió dos veces con resultados similares.
Por lo tanto, a continuación investigamos la correlación entre la señalización de GA y la actividad de división celular mediante la identificación de paredes celulares recién formadas durante el ensayo (Fig. 5e). Este enfoque nos permitió medir la frecuencia y la dirección de la división celular. Sorprendentemente, encontramos que la frecuencia de divisiones celulares en el IPR y el resto del SAM (no-IPR, Fig. 5f) era similar, lo que indica que las diferencias en la señalización de GA entre las células IPR y no-IPR no afectan significativamente la división celular. Esto, junto con la correlación positiva entre la señalización de GA y la anisotropía del crecimiento, nos llevó a considerar si la actividad de señalización de GA podría influir en la orientación del plano de división celular. Medimos la orientación de la nueva pared celular como un ángulo agudo con respecto al eje radial que conecta el centro del meristemo con el centro de la nueva pared celular (Fig. 5e-i) y observamos una clara tendencia de las células a dividirse en ángulos cercanos a 90° con respecto al eje radial, con las frecuencias más altas observadas a 70–80° (23,28%) y 80–90° (22,62%) (Fig. 5e,i), correspondientes a divisiones celulares en la dirección circunferencial/transversal (Fig. 5h). Para examinar la contribución de la señalización de GA a este comportamiento de división celular, analizamos los parámetros de división celular en el IPR y fuera del IPR por separado (Fig. 5i). Observamos que la distribución del ángulo de división en las células IPR difería de la de las células no IPR o de las células en todo el SAM, con las células IPR exhibiendo una mayor proporción de divisiones celulares laterales/circulares, es decir, 70–80° y 80–90° (33,86% y 30,71%, respectivamente, proporciones correspondientes) (Fig. 5i). Por lo tanto, nuestras observaciones revelaron una asociación entre la alta señalización de GA y una orientación del plano de división celular cercana a la dirección circunferencial, similar a la correlación entre la actividad de señalización de GA y la anisotropía del crecimiento (Fig. 5c, d). Para establecer aún más la conservación espacial de esta asociación, medimos la orientación del plano de división en las células IPR que rodean el primordio a partir de P3, ya que la mayor actividad de señalización de GA se detectó en esta región a partir de P4 (Fig. 4). Los ángulos de división de la IPR alrededor de P3 y P4 no mostraron diferencias estadísticamente significativas, aunque se observó una mayor frecuencia de divisiones celulares laterales en la IPR alrededor de P4 (Fig. 5j). Sin embargo, en las células IPR alrededor de P5, la diferencia en la orientación del plano de división celular se volvió estadísticamente significativa, con un marcado aumento en la frecuencia de divisiones celulares transversales (Fig. 5j). En conjunto, estos resultados sugieren que la señalización de GA puede controlar la orientación de las divisiones celulares en el SAM, lo cual es consistente con informes previos40,41 que indican que una alta señalización de GA puede inducir una orientación lateral de las divisiones celulares en el IPR.
Se predice que las células en la IPR no se incorporarán a los primordios, sino a los internodos2,42,43. La orientación transversal de las divisiones celulares en la IPR puede dar lugar a la organización típica de filas longitudinales paralelas de células epidérmicas en los internodos. Nuestras observaciones descritas anteriormente sugieren que la señalización de GA probablemente desempeña un papel en este proceso al regular la dirección de la división celular.
La pérdida de función de varios genes DELLA resulta en una respuesta constitutiva a GA, y los mutantes della pueden usarse para probar esta hipótesis44. Primero analizamos los patrones de expresión de cinco genes DELLA en el SAM. La fusión transcripcional de la línea GUS45 reveló que GAI, RGA, RGL1 y RGL2 (en mucha menor medida) se expresaban en el SAM (Fig. suplementaria 11a–d). La hibridación in situ demostró además que el ARNm de GAI se acumula específicamente en primordios y flores en desarrollo (Fig. suplementaria 11e). El ARNm de RGL1 y RGL3 se detectó en toda la cubierta del SAM y en flores más viejas, mientras que el ARNm de RGL2 fue más abundante en la región del borde (Fig. suplementaria 11f–h). La microscopía confocal de pRGL3::RGL3-GFP SAM confirmó la expresión observada mediante hibridación in situ y mostró que la proteína RGL3 se acumula en la parte central del SAM (Figura suplementaria 11i). Utilizando la línea pRGA::GFP-RGA, también encontramos que la proteína RGA se acumula en el SAM, pero su abundancia disminuye en el borde a partir de P4 (Figura suplementaria 11j). Cabe destacar que los patrones de expresión de RGL3 y RGA son consistentes con una mayor actividad de señalización de GA en el IPR, según lo detectado por qmRGA (Figura 4). Además, estos datos indican que todas las DELLA se expresan en el SAM y que su expresión colectiva abarca todo el SAM.
A continuación, analizamos los parámetros de división celular en el SAM de tipo silvestre (Ler, control) y en los mutantes quíntuples (globales) della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 (Fig. 6a, b). Curiosamente, observamos un cambio estadísticamente significativo en la distribución de las frecuencias de ángulos de división celular en el SAM del mutante global della en comparación con el tipo silvestre (Fig. 6c). Este cambio en el mutante global della se debió a un aumento en la frecuencia de ángulos de 80–90° (34,71% frente a 24,55%) y, en menor medida, de ángulos de 70–80° (23,78% frente a 20,18%), es decir, correspondientes a divisiones celulares transversales (Fig. 6c). La frecuencia de divisiones no transversales (0–60°) también fue menor en el mutante global della (Fig. 6c). La frecuencia de divisiones celulares transversales aumentó significativamente en el SAM del mutante global della (Fig. 6b). La frecuencia de divisiones celulares transversales en el IPR también fue mayor en el mutante global della en comparación con el tipo silvestre (Fig. 6d). Fuera de la región IPR, el tipo silvestre tenía una distribución más uniforme de ángulos de división celular, mientras que el mutante global della prefería divisiones tangenciales como el IPR (Fig. 6e). También cuantificamos la orientación de las divisiones celulares en el SAM de mutantes quíntuples de ga2 oxidasa (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 y ga2ox6-2), un fondo mutante inactivo de GA en el que se acumula GA. En consonancia con el aumento de los niveles de GA, el SAM de la inflorescencia del mutante quíntuple ga2ox fue mayor que el de Col-0 (Figura suplementaria 12a, b), y en comparación con Col-0, el SAM del mutante quíntuple ga2ox mostró una distribución claramente diferente de los ángulos de división celular, con una frecuencia angular que aumentó de 50° a 90°, es decir, favoreciendo nuevamente las divisiones tangenciales (Figura suplementaria 12a-c). Por lo tanto, demostramos que la activación constitutiva de la señalización de GA y la acumulación de GA inducen divisiones celulares laterales en el IPR y el resto del SAM.
a, b Visualización 3D de la capa L1 del SAM teñido con PI de Ler (a) y del mutante global della (b) mediante microscopía confocal. Se muestran las nuevas paredes celulares formadas en el SAM (pero no en el primordio) durante un período de 10 h y se colorean según sus valores angulares. El recuadro muestra el SAM a las 0 h. La barra de color se muestra en la esquina inferior derecha. La flecha en (b) apunta a un ejemplo de filas de células alineadas en el mutante global della. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. ce Comparación de la distribución de frecuencia de las orientaciones del plano de división celular en todo el SAM (d), IPR (e) y no-IPR (f) entre Ler y della global. Los valores p se obtuvieron mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos colas. f, g Visualización 3D de imágenes confocales del SAM teñido con PI de plantas transgénicas Col-0 (i) y pCUC2::gai-1-VENUS (j). Los paneles (a, b) muestran nuevas paredes celulares (pero no primordios) formadas en el SAM en 10 h. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. h–j Comparación de la distribución de frecuencia de las orientaciones del plano de división celular ubicadas en todo el SAM (h), IPR (i) y no IPR (j) entre plantas Col-0 y pCUC2::gai-1-VENUS. Los valores de P se obtuvieron mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos colas.
A continuación, probamos el efecto de inhibir la señalización de GA específicamente en el IPR. Para ello, utilizamos el promotor de la copa del cotiledón 2 (CUC2) para impulsar la expresión de una proteína gai-1 dominante negativa fusionada a VENUS (en la línea pCUC2::gai-1-VENUS). En el SAM de tipo silvestre, el promotor CUC2 impulsa la expresión de la mayoría de los IPR en el SAM, incluidas las células de borde, desde P4 en adelante, y se observó una expresión específica similar en las plantas pCUC2::gai-1-VENUS (véase más adelante). La distribución de los ángulos de división celular a través del SAM o IPR de las plantas pCUC2::gai-1-VENUS no fue significativamente diferente de la del tipo silvestre, aunque inesperadamente encontramos que las células sin IPR en estas plantas se dividieron con una frecuencia mayor de 80–90° (Fig. 6f–j).
Se ha sugerido que la dirección de la división celular depende de la geometría del SAM, en particular del estrés de tracción generado por la curvatura del tejido46. Por lo tanto, nos preguntamos si la forma del SAM estaba alterada en el mutante global della y en las plantas pCUC2::gai-1-VENUS. Como se informó anteriormente12, el tamaño del SAM del mutante global della era mayor que el del tipo silvestre (Fig. suplementaria 13a, b, d). La hibridación in situ del ARN CLV3 y STM confirmó la expansión del meristemo en los mutantes della y mostró además la expansión lateral del nicho de células madre (Fig. suplementaria 13e, f, h, i). Sin embargo, la curvatura del SAM era similar en ambos genotipos (Fig. suplementaria 13k, m, n, p). Observamos un aumento de tamaño similar en el mutante cuádruple gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della sin cambios en la curvatura en comparación con el tipo silvestre (Fig. suplementaria 13c, d, g, j, l, o, p). La frecuencia de la orientación de la división celular también se vio afectada en el mutante cuádruple della, pero en menor medida que en el mutante monolítico della (Fig. suplementaria 12d-f). Este efecto de dosis, junto con la falta de efecto sobre la curvatura, sugiere que la actividad residual de RGL3 en el mutante cuádruple Della limita los cambios en la orientación de la división celular causados por la pérdida de la actividad de DELLA y que los cambios en las divisiones celulares laterales ocurren en respuesta a cambios en la actividad de señalización de GA en lugar de cambios en la geometría del SAM. Como se describió anteriormente, el promotor CUC2 impulsa la expresión de IPR en el SAM a partir de P4 (Fig. suplementaria 14a, b), y en contraste, el SAM pCUC2::gai-1-VENUS tenía un tamaño reducido pero mayor curvatura (Fig. suplementaria 14c–h). Este cambio en la morfología del SAM pCUC2::gai-1-VENUS puede resultar en una distribución diferente de las tensiones mecánicas en comparación con el tipo silvestre, en el que las altas tensiones circunferenciales comienzan a una distancia más corta del centro del SAM47. Alternativamente, los cambios en la morfología del SAM pCUC2::gai-1-VENUS pueden resultar de cambios en las propiedades mecánicas regionales inducidos por la expresión del transgén48. En ambos casos, esto podría compensar parcialmente los efectos de los cambios en la señalización de GA al aumentar la probabilidad de que las células se dividan en la orientación circunferencial/transversal, lo que explica nuestras observaciones.
En conjunto, nuestros datos confirman que una mayor señalización de GA desempeña un papel activo en la orientación lateral del plano de división celular en la región intercelular (IPR). También demuestran que la curvatura del meristemo influye en la orientación de dicho plano.
La orientación transversal del plano de división en el IPR, debido a la alta actividad de señalización de GA, sugiere que GA preorganiza una fila de células radiales en la epidermis dentro del SAM para definir la organización celular que posteriormente se encontrará en el entrenudo epidérmico. De hecho, dichas filas de células fueron frecuentemente visibles en imágenes del SAM de mutantes globales della (Fig. 6b). Por lo tanto, para explorar más a fondo la función de desarrollo del patrón espacial de señalización de GA en el SAM, utilizamos imágenes de lapso de tiempo para analizar la organización espacial de las células en el IPR en plantas de tipo silvestre (Ler y Col-0), mutantes globales della y plantas transgénicas pCUC2::gai-1-VENUS.
Descubrimos que qmRGA mostró que la actividad de señalización de GA en el IPR aumentó desde P1/P2 y alcanzó su pico en P4, y este patrón se mantuvo constante a lo largo del tiempo (Fig. 4a–f y Fig. suplementaria 8c–f, k). Para analizar la organización espacial de las células en el IPR con el aumento de la señal de GA, etiquetamos las células Ler IPR por encima y a los lados de P4 según su destino de desarrollo analizado 34 h después de la primera observación, es decir, más de dos tiempos de plastidio, lo que nos permitió seguir las células IPR durante el desarrollo del primordio desde P1/P2 hasta P4. Usamos tres colores diferentes: amarillo para aquellas células que estaban integradas en el primordio cerca de P4, verde para aquellas que estaban en el IPR y púrpura para aquellas que participaron en ambos procesos (Fig. 7a–c). En t0 (0 h), 1–2 capas de células IPR eran visibles frente a P4 (Fig. 7a). Como era de esperar, cuando estas células se dividieron, lo hicieron principalmente a través del plano de división transversal (Figs. 7a–c). Se obtuvieron resultados similares utilizando Col-0 SAM (centrándonos en P3, cuyo borde se pliega de forma similar a P4 en Ler), aunque en este genotipo el pliegue formado en el borde floral ocultó las células IPR más rápidamente (Fig. 7g–i). Por lo tanto, el patrón de división de las células IPR preorganiza las células en filas radiales, como en los internodos. La organización de las filas radiales y la localización de las células IPR entre órganos sucesivos sugieren que estas células son progenitoras internodales.
Aquí, desarrollamos un biosensor de señalización de GA ratiométrico, qmRGA, que permite el mapeo cuantitativo de la actividad de señalización de GA resultante de las concentraciones combinadas de GA y su receptor, minimizando la interferencia con las vías de señalización endógenas, proporcionando así información sobre la función de GA a nivel celular. Para ello, construimos una proteína DELLA modificada, mRGA, que ha perdido la capacidad de unirse a los socios de interacción de DELLA, pero sigue siendo sensible a la proteólisis inducida por GA. qmRGA responde a cambios tanto exógenos como endógenos en los niveles de GA, y sus propiedades de detección dinámica permiten evaluar los cambios espaciotemporales en la actividad de señalización de GA durante el desarrollo. qmRGA también es una herramienta muy flexible, ya que puede adaptarse a diferentes tejidos cambiando el promotor utilizado para su expresión (si es necesario), y dada la naturaleza conservada de la vía de señalización de GA y el motivo PFYRE en las angiospermas, es probable que sea transferible a otras especies22. En consonancia con esto, también se demostró que una mutación equivalente en la proteína DELLA SLR1 del arroz (HYY497AAA) suprime la actividad represora del crecimiento de SLR1, aunque reduce ligeramente su degradación mediada por GA, de forma similar a mRGA23. Cabe destacar que estudios recientes en Arabidopsis mostraron que una única mutación de aminoácido en el dominio PFYRE (S474L) alteró la actividad transcripcional de RGA sin afectar su capacidad de interactuar con los factores de transcripción asociados50. Si bien esta mutación es muy similar a las 3 sustituciones de aminoácidos presentes en mRGA, nuestros estudios muestran que estas dos mutaciones alteran características distintas de DELLA. Aunque la mayoría de los factores de transcripción asociados se unen a los dominios LHR1 y SAW de DELLA26,51, algunos aminoácidos conservados en el dominio PFYRE pueden ayudar a estabilizar estas interacciones.
El desarrollo del entrenudo es un rasgo clave en la arquitectura de la planta y la mejora del rendimiento. qmRGA reveló una mayor actividad de señalización de GA en las células progenitoras del entrenudo IPR. Al combinar imágenes cuantitativas y genética, mostramos que los patrones de señalización de GA superponen planos de división celular circulares/transversales en la epidermis SAM, dando forma a la organización de la división celular necesaria para el desarrollo del entrenudo. Se han identificado varios reguladores de la orientación del plano de división celular durante el desarrollo52,53. Nuestro trabajo proporciona un ejemplo claro de cómo la actividad de señalización de GA regula este parámetro celular. DELLA puede interactuar con complejos de proteínas de preplegamiento41, por lo que la señalización de GA puede regular la orientación del plano de división celular al influir directamente en la orientación de los microtúbulos corticales40,41,54,55. Inesperadamente mostramos que en SAM, el correlato de una mayor actividad de señalización de GA no era la elongación o división celular, sino solo la anisotropía del crecimiento, lo que es consistente con un efecto directo de GA en la dirección de la división celular en el IPR. Sin embargo, no podemos excluir que este efecto también pueda ser indirecto, por ejemplo, mediado por el ablandamiento de la pared celular inducido por GA56. Los cambios en las propiedades de la pared celular inducen estrés mecánico57,58, que también puede influir en la orientación del plano de división celular al afectar la orientación de los microtúbulos corticales39,46,59. Los efectos combinados del estrés mecánico inducido por GA y la regulación directa de la orientación de los microtúbulos por GA pueden estar involucrados en la generación de un patrón específico de orientación de la división celular en el IPR para definir los internodos, y se necesitan más estudios para probar esta idea. De manera similar, estudios previos han resaltado la importancia de las proteínas TCP14 y 15 que interactúan con DELLA en el control de la formación de internodos60,61 y estos factores pueden mediar la acción de GA junto con BREVIPEDICELLUS (BP) y PENNYWISE (PNY), que regulan el desarrollo de internodos y se ha demostrado que influyen en la señalización de GA2,62. Dado que las DELLA interactúan con las vías de señalización de brasinoesteroides, etileno, ácido jasmónico y ácido abscísico (ABA)63,64 y que estas hormonas pueden influir en la orientación de los microtúbulos65, los efectos de GA sobre la orientación de la división celular también pueden estar mediados por otras hormonas.
Estudios citológicos iniciales demostraron que tanto la región interna como la externa del meristemo apical del tallo (SAM) de Arabidopsis son necesarias para el desarrollo de los entrenudos2,42. El hecho de que la GA regule activamente la división celular en los tejidos internos12 respalda una doble función de la GA en la regulación del tamaño del meristemo y del entrenudo en el SAM. El patrón de división celular direccional también está estrictamente regulado en el tejido interno del SAM, y esta regulación es esencial para el crecimiento del tallo52. Será interesante examinar si la GA también desempeña un papel en la orientación del plano de división celular en la organización interna del SAM, sincronizando así la especificación y el desarrollo de los entrenudos dentro del SAM.
Las plantas se cultivaron in vitro en suelo o en medio Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) suplementado con 1 % de sacarosa y 1 % de agar (Sigma) en condiciones estándar (16 h de luz, 22 °C), excepto en los experimentos de crecimiento de hipocótilo y raíz, en los que las plántulas se cultivaron en placas verticales bajo luz constante y a 22 °C. Para los experimentos con nitrato, las plantas se cultivaron en medio MS modificado (medio para plantas bioWORLD) suplementado con nitrato adecuado (0 o 10 mM de KNO3), 0,5 mM de succinato de NH4, 1 % de sacarosa y 1 % de agar A (Sigma) en condiciones de día largo.
El ADNc de GID1a insertado en pDONR221 se recombinó con pDONR P4-P1R-pUBQ10 y pDONR P2R-P3-mCherry en pB7m34GW para generar pUBQ10::GID1a-mCherry. El ADN de IDD2 insertado en pDONR221 se recombinó en pB7RWG266 para generar p35S:IDD2-RFP. Para generar pGID1b::2xmTQ2-GID1b, primero se amplificó un fragmento de 3,9 kb aguas arriba de la región codificante de GID1b y un fragmento de 4,7 kb que contenía el ADNc de GID1b (1,3 kb) y el terminador (3,4 kb) utilizando los cebadores de la Tabla Suplementaria 3 y luego se insertaron en pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) y pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respectivamente, y finalmente se recombinaron con pDONR221 2xmTQ268 en el vector objetivo pGreen 012567 utilizando la clonación Gateway. Para generar pCUC2::LSSmOrange, la secuencia promotora de CUC2 (3229 pb aguas arriba de ATG) seguida de la secuencia codificante de mOrange grande con desplazamiento de Stokes (LSSmOrange)69 con la señal de localización nuclear N7 y el terminador transcripcional NOS se ensamblaron en el vector de direccionamiento de kanamicina pGreen utilizando el sistema de recombinación de 3 fragmentos Gateway (Invitrogen). El vector binario vegetal se introdujo en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens y en hojas de Nicotiana benthamiana mediante el método de infiltración de Agrobacterium y en Arabidopsis thaliana Col-0 mediante el método de inmersión floral, respectivamente. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry y pCLV3::mCherry-NLS qmRGA se aislaron de las progenies F3 y F1 de los cruces respectivos, respectivamente.
Se realizó hibridación in situ de ARN en ápices de brotes de aproximadamente 1 cm de longitud72, los cuales se recolectaron y fijaron inmediatamente en solución FAA (3,7 % de formaldehído, 5 % de ácido acético, 50 % de etanol) preenfriada a 4 °C. Después de 2 tratamientos de vacío de 15 min, se cambió el fijador y las muestras se incubaron durante la noche. Los ADNc de GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 y RGL3 y las sondas antisentido para sus 3′-UTR se sintetizaron utilizando los cebadores que se muestran en la Tabla Suplementaria 3 como lo describieron Rosier et al.73. Las sondas marcadas con digoxigenina se detectaron mediante inmunodetección utilizando anticuerpos contra digoxigenina (dilución 3000 veces; Roche, número de catálogo: 11 093 274 910), y las secciones se tiñeron con una solución de 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP, dilución 250 veces)/nitroazul de tetrazolio (NBT, dilución 200 veces).
Hora de publicación: 10 de febrero de 2025