Un biosensor cuantitativo de giberelinas revela el papel de las giberelinas en la especificación de los entrenudos en el meristemo apical del brote.

El crecimiento del meristemo apical del brote (SAM) es crucial para la arquitectura del tallo. Hormonas vegetales.giberelinasLas GA desempeñan un papel fundamental en la coordinación del crecimiento vegetal, pero su papel en el SAM aún se comprende poco. En este estudio, desarrollamos un biosensor raciométrico de la señalización de GA mediante la ingeniería de la proteína DELLA para suprimir su función reguladora esencial en la respuesta transcripcional de GA, preservando al mismo tiempo su degradación tras su reconocimiento. Demostramos que este biosensor basado en la degradación registra con precisión los cambios en los niveles de GA y la detección celular durante el desarrollo. Utilizamos este biosensor para mapear la actividad de señalización de GA en el SAM. Demostramos que las señales altas de GA están presentes predominantemente en células ubicadas entre los primordios de los órganos, precursores de las células de los entrenudos. Mediante enfoques de ganancia y pérdida de función, demostramos además que GA regula la orientación del plano de división celular, estableciendo la organización celular canónica de los entrenudos y, por lo tanto, promoviendo la especificación de los entrenudos en el SAM.
El meristemo apical del brote (SAM), ubicado en el ápice del brote, contiene un nicho de células madre cuya actividad genera órganos laterales y nudos troncales de forma modular e iterativa a lo largo de la vida de la planta. Cada una de estas unidades repetitivas, o nudos vegetales, incluye entrenudos y órganos laterales en los nudos, y meristemos axilares en las axilas de las hojas1. El crecimiento y la organización de los nudos vegetales cambian durante el desarrollo. En Arabidopsis, el crecimiento internodal se suprime durante la etapa vegetativa, y los meristemos axilares permanecen latentes en las axilas de las hojas en roseta. Durante la transición a la fase floral, el SAM se convierte en el meristemo de la inflorescencia, generando entrenudos alargados y yemas axilares, ramitas en las axilas de las hojas caulinares y, posteriormente, flores sin hojas2. Si bien hemos avanzado significativamente en la comprensión de los mecanismos que controlan la iniciación de las hojas, las flores y las ramas, se sabe relativamente poco sobre cómo surgen los entrenudos.
Comprender la distribución espaciotemporal de las GA ayudará a comprender mejor las funciones de estas hormonas en diferentes tejidos y en diferentes etapas del desarrollo. La visualización de la degradación de la fusión RGA-GFP expresada bajo la acción de su propio promotor proporciona información importante sobre la regulación de los niveles totales de GA en las raíces15,16. Sin embargo, la expresión de RGA varía entre los tejidos17 y está regulada por GA18. Por lo tanto, la expresión diferencial del promotor de RGA puede resultar en el patrón de fluorescencia observado con RGA-GFP y, por lo tanto, este método no es cuantitativo. Más recientemente, la GA bioactiva marcada con fluoresceína (Fl)19,20 reveló la acumulación de GA en el endocórtex radicular y la regulación de sus niveles celulares por el transporte de GA. Recientemente, el sensor FRET de GA nlsGPS1 mostró que los niveles de GA se correlacionan con la elongación celular en raíces, filamentos e hipocótilos de crecimiento oscuro21. Sin embargo, como hemos visto, la concentración de GA no es el único parámetro que controla la actividad de señalización de GA, ya que depende de procesos de detección complejos. Aquí, basándonos en nuestro conocimiento de las vías de señalización de DELLA y GA, informamos del desarrollo y la caracterización de un biosensor raciométrico basado en la degradación para la señalización de GA. Para desarrollar este biosensor cuantitativo, utilizamos un RGA mutante sensible a GA que se fusionó a una proteína fluorescente y se expresó ubicuamente en los tejidos, así como una proteína fluorescente insensible a GA. Demostramos que las fusiones de proteínas RGA mutantes no interfieren con la señalización endógena de GA cuando se expresa ubicuamente, y que este biosensor puede cuantificar la actividad de señalización resultante tanto de la entrada de GA como del procesamiento de la señal de GA por el aparato sensor con alta resolución espaciotemporal. Utilizamos este biosensor para mapear la distribución espaciotemporal de la actividad de señalización de GA y cuantificar cómo GA regula el comportamiento celular en la epidermis SAM. Demostramos que GA regula la orientación del plano de división de las células SAM ubicadas entre los primordios de los órganos, definiendo así la organización celular canónica del entrenudo.
Finalmente, nos preguntamos si qmRGA podría reportar cambios en los niveles endógenos de GA usando hipocótilos en crecimiento. Previamente demostramos que el nitrato estimula el crecimiento al aumentar la síntesis de GA y, a su vez, la degradación de DELLA34. En consecuencia, observamos que la longitud del hipocótilo en plántulas pUBQ10::qmRGA cultivadas bajo un suministro abundante de nitrato (10 mM NO3−) fue significativamente mayor que en plántulas cultivadas bajo condiciones deficientes de nitrato (Fig. Suplementaria 6a). Consistente con la respuesta de crecimiento, las señales de GA fueron mayores en los hipocótilos de plántulas cultivadas bajo condiciones de 10 mM NO3− que en plántulas cultivadas en ausencia de nitrato (Fig. Suplementaria 6b, c). Por lo tanto, qmRGA también permite monitorear los cambios en la señalización de GA inducidos por cambios endógenos en la concentración de GA.
Para comprender si la actividad de señalización de GA detectada por qmRGA depende de la concentración de GA y la percepción de GA, como se esperaba con base en el diseño del sensor, analizamos la expresión de los tres receptores GID1 en tejidos vegetativos y reproductivos. En plántulas, la línea reportera GID1-GUS mostró que GID1a y c se expresaron altamente en cotiledones (Fig. 3a-c). Además, los tres receptores se expresaron en hojas, primordios de raíces laterales, ápices radiculares (excepto el capuchón radicular de GID1b) y el sistema vascular (Fig. 3a-c). En el SAM de la inflorescencia, detectamos señales GUS solo para GID1b e 1c (Fig. 7a-c suplementaria). La hibridación in situ confirmó estos patrones de expresión y demostró además que GID1c se expresó uniformemente a niveles bajos en el SAM, mientras que GID1b mostró una mayor expresión en la periferia del SAM (Fig. 7d-l suplementaria). La fusión traduccional pGID1b::2xmTQ2-GID1b también reveló un rango gradual de expresión de GID1b, desde baja o nula expresión en el centro del SAM hasta alta expresión en los bordes del órgano (Fig. Suplementaria 7m). Por lo tanto, los receptores GID1 no se distribuyen uniformemente a través de los tejidos ni dentro de ellos. En experimentos posteriores, también observamos que la sobreexpresión de GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) aumentó la sensibilidad de qmRGA en hipocótilos a la aplicación externa de GA (Fig. 3d, e). Por el contrario, la fluorescencia medida por qd17mRGA en el hipocótilo fue insensible al tratamiento con GA3 (Fig. 3f, g). En ambos ensayos, las plántulas se trataron con altas concentraciones de GA (100 μM de GA3) para evaluar el comportamiento rápido del sensor, donde la capacidad de unirse al receptor GID1 aumentó o se perdió. En conjunto, estos resultados confirman que el biosensor qmRGA cumple una función combinada como sensor GA y GA, y sugieren que la expresión diferencial del receptor GID1 puede modular significativamente la emisividad del sensor.
Hasta la fecha, la distribución de las señales de GA en el SAM sigue siendo incierta. Por lo tanto, utilizamos plantas que expresan qmRGA y el reportero de células madre pCLV3::mCherry-NLS35 para calcular mapas cuantitativos de alta resolución de la actividad de señalización de GA, centrándonos en la capa L1 (epidermis; Fig. 4a, b, véanse Métodos y Métodos Suplementarios), ya que L1 desempeña un papel fundamental en el control del crecimiento del SAM36. En este caso, la expresión de pCLV3::mCherry-NLS proporcionó un punto de referencia geométrico fijo para analizar la distribución espaciotemporal de la actividad de señalización de GA37. Aunque GA se considera esencial para el desarrollo de los órganos laterales4, observamos que las señales de GA fueron bajas en el primordio floral (P) a partir del estadio P3 (Fig. 4a, b), mientras que los primordios jóvenes P1 y P2 presentaron una actividad moderada similar a la de la región central (Fig. 4a, b). Se detectó una mayor actividad de señalización de GA en los límites de los primordios orgánicos, comenzando en P1/P2 (a los lados del límite) y alcanzando un máximo en P4, así como en todas las células de la región periférica ubicada entre los primordios (Fig. 4a, b y Fig. Suplementaria 8a, b). Esta mayor actividad de señalización de GA se observó no solo en la epidermis, sino también en las capas L2 y L3 superior (Fig. Suplementaria 8b). El patrón de señales de GA detectado en el SAM utilizando qmRGA también se mantuvo sin cambios a lo largo del tiempo (Fig. Suplementaria 8c–f, k). Aunque el constructo qd17mRGA se reguló negativamente sistemáticamente en el SAM de plantas T3 de cinco líneas independientes que caracterizamos en detalle, pudimos analizar los patrones de fluorescencia obtenidos con el constructo pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Fig. Suplementaria 8g–j, l). En esta línea de control, solo se detectaron cambios menores en la proporción de fluorescencia en el SAM, pero en el centro del SAM observamos una disminución clara e inesperada de VENUS asociada con TagBFP. Esto confirma que el patrón de señalización observado por qmRGA refleja la degradación dependiente de GA de mRGA-VENUS, pero también demuestra que qmRGA puede sobreestimar la actividad de señalización de GA en el centro del meristemo. En resumen, nuestros resultados revelan un patrón de señalización de GA que refleja principalmente la distribución de los primordios. Esta distribución de la región interprimordial (IPR) se debe al establecimiento gradual de una alta actividad de señalización de GA entre el primordio en desarrollo y la región central, mientras que, al mismo tiempo, la actividad de señalización de GA en el primordio disminuye (Fig. 4c, d).
La distribución de los receptores GID1b y GID1c (ver arriba) sugiere que la expresión diferencial de los receptores GA ayuda a moldear el patrón de la actividad de señalización de GA en el SAM. Nos preguntamos si la acumulación diferencial de GA podría estar involucrada. Para investigar esta posibilidad, utilizamos el sensor FRET de GA nlsGPS121. Se detectó un aumento en la frecuencia de activación en el SAM de nlsGPS1 tratado con 10 μM GA4+7 durante 100 min (Fig. Suplementaria 9a–e), lo que indica que nlsGPS1 responde a los cambios en la concentración de GA en el SAM, como lo hace en las raíces21. La distribución espacial de la frecuencia de activación de nlsGPS1 reveló niveles de GA relativamente bajos en las capas externas del SAM, pero mostró que estaban elevados en el centro y en los bordes del SAM (Fig. 4e y Fig. Suplementaria 9a,c). Esto sugiere que GA también se distribuye en el SAM con un patrón espacial comparable al revelado por qmRGA. Como enfoque complementario, también tratamos el SAM con GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) o Fl solo como control negativo. La señal de Fl se distribuyó por todo el SAM, incluyendo la región central y el primordio, aunque a menor intensidad (Fig. 4j y Fig. 10d suplementaria). Por el contrario, los tres GA-Fl se acumularon específicamente dentro de los bordes del primordio y en diversos grados en el resto del IPR, acumulándose GA7-Fl en el dominio más grande del IPR (Fig. 4k y Fig. 10a,b suplementarias). La cuantificación de la intensidad de fluorescencia reveló que la razón de intensidad de IPR a no IPR fue mayor en el SAM tratado con GA-Fl en comparación con el SAM tratado con Fl (Fig. 4l y Fig. 10c suplementaria). En conjunto, estos resultados sugieren que GA está presente en concentraciones más altas en las células IPR que se encuentran más cerca del borde del órgano. Esto sugiere que el patrón de actividad de señalización de GA en SAM se debe tanto a la expresión diferencial de los receptores de GA como a la acumulación diferencial de GA en las células IPR cerca de los bordes de los órganos. Por lo tanto, nuestro análisis reveló un patrón espaciotemporal inesperado de señalización de GA, con menor actividad en el centro y el primordio del SAM y mayor actividad en el IPR en la región periférica.
Para comprender el papel de la actividad de señalización diferencial de GA en el SAM, analizamos la correlación entre la actividad de señalización de GA, la expansión celular y la división celular mediante imágenes time-lapse en tiempo real del qmRGA pCLV3::mCherry-NLS del SAM. Dado el papel de GA en la regulación del crecimiento, se esperaba una correlación positiva con los parámetros de expansión celular. Por lo tanto, primero comparamos los mapas de actividad de señalización de GA con los mapas de la tasa de crecimiento de la superficie celular (como indicador de la intensidad de la expansión celular para una célula dada y para las células hijas en la división) y con los mapas de anisotropía del crecimiento, que mide la direccionalidad de la expansión celular (también utilizados aquí para una célula dada y para las células hijas en la división; Fig. 5a,b, véanse Métodos y Métodos Suplementarios). Nuestros mapas de la tasa de crecimiento de la superficie celular del SAM coinciden con observaciones previas38,39, con tasas de crecimiento mínimas en el borde y tasas de crecimiento máximas en flores en desarrollo (Fig. 5a). El análisis de componentes principales (PCA) mostró que la actividad de señalización de GA se correlacionó negativamente con la intensidad del crecimiento de la superficie celular (Figura 5c). También demostramos que los principales ejes de variación, incluyendo la entrada de la señalización de GA y la intensidad del crecimiento, fueron ortogonales a la dirección determinada por la alta expresión de CLV3, lo que confirma la exclusión de células del centro SAM en los análisis restantes. El análisis de correlación de Spearman confirmó los resultados del ACP (Figura 5d), lo que indica que una mayor señal de GA en el IPR no resultó en una mayor expansión celular. Sin embargo, el análisis de correlación reveló una ligera correlación positiva entre la actividad de señalización de GA y la anisotropía del crecimiento (Figuras 5c, d), lo que sugiere que una mayor señal de GA en el IPR influye en la dirección del crecimiento celular y posiblemente en la posición del plano de división celular.
a, b Mapas de calor del crecimiento superficial medio (a) y la anisotropía del crecimiento (b) en SAM promediados en siete plantas independientes (usados ​​como indicadores de la fuerza y ​​dirección de la expansión celular, respectivamente). c El análisis de PCA incluyó las siguientes variables: señal de GA, intensidad del crecimiento superficial, anisotropía del crecimiento superficial y expresión de CLV3. El componente 1 de PCA se correlacionó principalmente de forma negativa con la intensidad del crecimiento superficial y de forma positiva con la señal de GA. El componente 2 de PCA se correlacionó principalmente de forma positiva con la anisotropía del crecimiento superficial y de forma negativa con la expresión de CLV3. Los porcentajes representan la variación explicada por cada componente. d Análisis de correlación de Spearman entre la señal de GA, la intensidad del crecimiento superficial y la anisotropía del crecimiento superficial a escala tisular excluyendo CZ. El número de la derecha es el valor rho de Spearman entre dos variables. Los asteriscos indican los casos en los que la correlación/correlación negativa es altamente significativa. e Visualización 3D de células Col-0 SAM L1 mediante microscopía confocal. Las nuevas paredes celulares formadas en el SAM (pero no en el primordio) a las 10 h se colorean según sus valores de ángulo. La barra de color se muestra en la esquina inferior derecha. El recuadro muestra la imagen 3D correspondiente a las 0 h. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. f Los diagramas de caja muestran las tasas de división celular en SAM Col-0 IPR y no IPR (n = 10 plantas independientes). La línea central muestra la mediana y los límites de la caja indican los percentiles 25 y 75. Los bigotes indican los valores mínimo y máximo determinados con el software R. Los valores P se obtuvieron con la prueba t de dos colas de Welch. g, h Diagrama esquemático que muestra (g) cómo medir el ángulo de la nueva pared celular (magenta) con respecto a la dirección radial desde el centro del SAM (línea punteada blanca) (solo se consideran los valores de ángulo agudo, es decir, 0–90°), y (h) las direcciones circunferencial/lateral y radial dentro del meristemo. i Histogramas de frecuencia de la orientación del plano de división celular a lo largo del SAM (azul oscuro), IPR (azul medio) y sin IPR (azul claro), respectivamente. Los valores de p se obtuvieron mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov bilateral. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. j Histogramas de frecuencia de la orientación del plano de división celular del IPR alrededor de P3 (verde claro), P4 (verde medio) y P5 (verde oscuro), respectivamente. Los valores de p se obtuvieron mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov bilateral. El experimento se repitió dos veces con resultados similares.
Por lo tanto, investigamos la correlación entre la señalización de GA y la actividad de división celular mediante la identificación de las paredes celulares recién formadas durante el ensayo (Fig. 5e). Este enfoque nos permitió medir la frecuencia y la dirección de la división celular. Sorprendentemente, descubrimos que la frecuencia de las divisiones celulares en el IPR y el resto del SAM (sin IPR, Fig. 5f) fue similar, lo que indica que las diferencias en la señalización de GA entre células con IPR y sin IPR no afectan significativamente la división celular. Esto, junto con la correlación positiva entre la señalización de GA y la anisotropía del crecimiento, nos llevó a considerar si la actividad de la señalización de GA podría influir en la orientación del plano de división celular. Medimos la orientación de la nueva pared celular como un ángulo agudo con respecto al eje radial que conecta el centro del meristemo con el centro de la nueva pared celular (Fig. 5e-i) y observamos una clara tendencia a la división celular en ángulos cercanos a los 90° con respecto al eje radial, con las frecuencias más altas observadas en 70-80° (23,28%) y 80-90° (22,62%) (Fig. 5e,i), correspondientes a divisiones celulares en dirección circunferencial/transversal (Fig. 5h). Para examinar la contribución de la señalización de GA a este comportamiento de división celular, analizamos los parámetros de división celular en el IPR y en el no IPR por separado (Fig. 5i). Observamos que la distribución del ángulo de división en células IPR difería de aquella en células no IPR o en células en todo el SAM, con células IPR exhibiendo una mayor proporción de divisiones celulares laterales/circulares, es decir, 70–80° y 80–90° (33.86% y 30.71%, respectivamente, proporciones correspondientes) (Fig. 5i). Por lo tanto, nuestras observaciones revelaron una asociación entre alta señalización de GA y una orientación del plano de división celular cercana a la dirección circunferencial, similar a la correlación entre la actividad de señalización de GA y anisotropía de crecimiento (Fig. 5c, d). Para establecer aún más la conservación espacial de esta asociación, medimos la orientación del plano de división en células IPR rodeando el primordio comenzando desde P3, ya que la mayor actividad de señalización de GA se detectó en esta región comenzando desde P4 (Fig. 4). Los ángulos de división del IPR alrededor de P3 y P4 no mostraron diferencias estadísticamente significativas, aunque se observó una mayor frecuencia de divisiones celulares laterales en el IPR alrededor de P4 (Fig. 5j). Sin embargo, en las células IPR alrededor de P5, la diferencia en la orientación del plano de división celular se volvió estadísticamente significativa, con un marcado aumento en la frecuencia de divisiones celulares transversales (Fig. 5j). En conjunto, estos resultados sugieren que la señalización de GA puede controlar la orientación de las divisiones celulares en el SAM, lo cual concuerda con estudios previos40,41 que indican que una alta señalización de GA puede inducir la orientación lateral de las divisiones celulares en el IPR.
Se predice que las células en el IPR no se incorporarán a los primordios, sino a los entrenudos2,42,43. La orientación transversal de las divisiones celulares en el IPR puede resultar en la organización típica de filas longitudinales paralelas de células epidérmicas en los entrenudos. Nuestras observaciones descritas anteriormente sugieren que la señalización de GA probablemente desempeña un papel en este proceso al regular la dirección de la división celular.
La pérdida de función de varios genes DELLA resulta en una respuesta constitutiva de GA, y los mutantes della pueden usarse para probar esta hipótesis44. Primero analizamos los patrones de expresión de cinco genes DELLA en el SAM. La fusión transcripcional de la línea GUS45 reveló que GAI, RGA, RGL1 y RGL2 (en un grado mucho menor) se expresaron en el SAM (Fig. Suplementaria 11a-d). La hibridación in situ demostró además que el ARNm de GAI se acumula específicamente en los primordios y las flores en desarrollo (Fig. Suplementaria 11e). El ARNm de RGL1 y RGL3 se detectó en todo el dosel del SAM y en las flores más viejas, mientras que el ARNm de RGL2 fue más abundante en la región del borde (Fig. Suplementaria 11f-h). La imagen confocal del SAM pRGL3::RGL3-GFP confirmó la expresión observada mediante hibridación in situ y mostró que la proteína RGL3 se acumula en la parte central del SAM (Fig. 11i). Utilizando la línea pRGA::GFP-RGA, también observamos que la proteína RGA se acumula en el SAM, pero su abundancia disminuye en el borde a partir de P4 (Fig. 11j). Cabe destacar que los patrones de expresión de RGL3 y RGA son consistentes con una mayor actividad de señalización de GA en el IPR, detectada mediante qmRGA (Fig. 4). Además, estos datos indican que todas las DELLA se expresan en el SAM y que su expresión colectiva abarca todo el SAM.
A continuación, analizamos los parámetros de división celular en el SAM de tipo silvestre (Ler, control) y los mutantes gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Fig. 6a, b). Curiosamente, observamos un cambio estadísticamente significativo en la distribución de las frecuencias de los ángulos de división celular en el SAM mutante della global en comparación con el tipo silvestre (Fig. 6c). Este cambio en el mutante della global se debió a un aumento en la frecuencia de los ángulos de 80–90° (34,71% frente a 24,55%) y, en menor medida, de los ángulos de 70–80° (23,78% frente a 20,18%), es decir, correspondientes a divisiones celulares transversales (Fig. 6c). La frecuencia de las divisiones no transversales (0–60°) también fue menor en el mutante della global (Fig. 6c). La frecuencia de divisiones celulares transversales aumentó significativamente en el SAM del mutante della global (Fig. 6b). La frecuencia de divisiones celulares transversales en el IPR también fue mayor en el mutante della global en comparación con el tipo silvestre (Fig. 6d). Fuera de la región IPR, el tipo silvestre presentó una distribución más uniforme de ángulos de división celular, mientras que el mutante della global prefirió divisiones tangenciales como el IPR (Fig. 6e). También cuantificamos la orientación de las divisiones celulares en el SAM de mutantes quíntuples de la ga2 oxidasa (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 y ga2ox6-2), un fondo mutante inactivo para GA en el que GA se acumula. En consonancia con el aumento de los niveles de GA, el SAM de la inflorescencia del mutante quíntuple ga2ox fue mayor que el de Col-0 (Fig. Suplementaria 12a, b). En comparación con Col-0, el SAM quíntuple ga2ox mostró una distribución claramente diferente de los ángulos de división celular, con una frecuencia angular que aumentó de 50° a 90°, lo que nuevamente favoreció las divisiones tangenciales (Fig. Suplementaria 12a-c). Por lo tanto, demostramos que la activación constitutiva de la señalización de GA y su acumulación inducen divisiones celulares laterales en el IPR y el resto del SAM.
a, b Visualización 3D de la capa L1 de Ler teñido con PI (a) y SAM del mutante della global (b) mediante microscopía confocal. Se muestran las nuevas paredes celulares formadas en el SAM (pero no en el primordio) durante un período de 10 h, coloreadas según sus valores angulares. El recuadro muestra el SAM a las 0 h. La barra de color se muestra en la esquina inferior derecha. La flecha en (b) señala un ejemplo de archivos de células alineados en el mutante della global. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. ce Comparación de la distribución de frecuencias de las orientaciones del plano de división celular en el SAM completo (d), IPR (e) y no IPR (f) entre Ler y della global. Los valores P se obtuvieron utilizando una prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos colas. f, g Visualización 3D de imágenes confocales de SAM teñido con PI de plantas transgénicas Col-0 (i) y pCUC2::gai-1-VENUS (j). Los paneles (a, b) muestran las nuevas paredes celulares (pero no los primordios) formadas en el SAM en 10 h. El experimento se repitió dos veces con resultados similares. h–j Comparación de la distribución de frecuencias de las orientaciones del plano de división celular en todo el SAM (h), IPR (i) y no IPR (j) entre plantas Col-0 y pCUC2::gai-1-VENUS. Los valores p se obtuvieron mediante una prueba de Kolmogorov-Smirnov bilateral.
A continuación, evaluamos el efecto de inhibir la señalización de GA específicamente en el IPR. Para ello, utilizamos el promotor de la copa del cotiledón 2 (CUC2) para impulsar la expresión de una proteína gai-1 negativa dominante fusionada a VENUS (en la línea pCUC2::gai-1-VENUS). En el SAM de tipo silvestre, el promotor CUC2 impulsa la expresión de la mayoría de los IPR en el SAM, incluidas las células del borde, a partir de P4, y se observó una expresión específica similar en las plantas pCUC2::gai-1-VENUS (véase más adelante). La distribución de los ángulos de división celular a lo largo del SAM o el IPR de las plantas pCUC2::gai-1-VENUS no fue significativamente diferente de la del tipo silvestre, aunque inesperadamente encontramos que las células sin un IPR en estas plantas se dividieron a una frecuencia más alta de 80–90° (Fig. 6f–j).
Se ha sugerido que la dirección de la división celular depende de la geometría del SAM, en particular de la tensión de tracción generada por la curvatura del tejido46. Por lo tanto, nos preguntamos si la forma del SAM se alteró en las plantas del mutante global della y pCUC2::gai-1-VENUS. Como se informó previamente12, el tamaño del SAM del mutante global della fue mayor que el del tipo silvestre (Fig. Suplementaria 13a, b, d). La hibridación in situ de CLV3 y ARN de STM confirmó la expansión del meristemo en mutantes della y mostró además la expansión lateral del nicho de células madre (Fig. Suplementaria 13e, f, h, i). Sin embargo, la curvatura del SAM fue similar en ambos genotipos (Fig. Suplementaria 13k, m, n, p). Observamos un aumento similar en el tamaño en el mutante cuádruple della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 sin un cambio en la curvatura en comparación con el tipo silvestre (Fig. 13c, d, g, j, l, o, p del suplemento). La frecuencia de la orientación de la división celular también se vio afectada en el mutante cuádruple della, pero en menor medida que en el mutante monolítico della (Fig. 12d–f del suplemento). Este efecto de la dosis, junto con la falta de un efecto en la curvatura, sugiere que la actividad residual de RGL3 en el mutante cuádruple Della limita los cambios en la orientación de la división celular causados ​​por la pérdida de la actividad de DELLA y que los cambios en las divisiones celulares laterales ocurren en respuesta a cambios en la actividad de señalización de GA en lugar de cambios en la geometría de SAM. Como se describió anteriormente, el promotor CUC2 impulsa la expresión de IPR en el SAM a partir de P4 (Fig. Suplementaria 14a, b), y en contraste, el SAM pCUC2::gai-1-VENUS tuvo un tamaño reducido pero una curvatura más alta (Fig. Suplementaria 14c–h). Este cambio en la morfología del SAM pCUC2::gai-1-VENUS puede resultar en una distribución diferente de tensiones mecánicas en comparación con el tipo silvestre, en el que las altas tensiones circunferenciales comienzan a una distancia más corta del centro del SAM47. Alternativamente, los cambios en la morfología del SAM pCUC2::gai-1-VENUS pueden resultar de cambios en las propiedades mecánicas regionales inducidos por la expresión del transgén48. En ambos casos, esto podría compensar parcialmente los efectos de los cambios en la señalización de GA al aumentar la probabilidad de que las células se dividan en la orientación circunferencial/transversal, lo que explica nuestras observaciones.
En conjunto, nuestros datos confirman que una mayor señalización de GA desempeña un papel activo en la orientación lateral del plano de división celular en el IPR. También muestran que la curvatura del meristemo también influye en la orientación del plano de división celular en el IPR.
La orientación transversal del plano de división en el IPR, debido a la alta actividad de señalización de GA, sugiere que GA preorganiza un archivo celular radial en la epidermis dentro del SAM para definir la organización celular que posteriormente se encontrará en el entrenudo epidérmico. De hecho, estos archivos celulares fueron visibles con frecuencia en imágenes de SAM de mutantes della global (Fig. 6b). Por lo tanto, para explorar más a fondo la función del patrón espacial de la señalización de GA en el SAM durante el desarrollo, utilizamos imágenes time-lapse para analizar la organización espacial de las células en el IPR en plantas silvestres (Ler y Col-0), mutantes della global y plantas transgénicas pCUC2::gai-1-VENUS.
Descubrimos que qmRGA mostró que la actividad de señalización de GA en el IPR aumentó desde P1/P2 y alcanzó su punto máximo en P4, y este patrón permaneció constante a lo largo del tiempo (Fig. 4a–f y Fig. Suplementaria 8c–f, k). Para analizar la organización espacial de las células en el IPR con el aumento de la señal de GA, etiquetamos las células Ler IPR por encima y a los lados de P4 de acuerdo con su destino de desarrollo analizado 34 h después de la primera observación, es decir, más de dos tiempos de plástido, lo que nos permitió seguir las células IPR durante el desarrollo del primordio desde P1/P2 hasta P4. Usamos tres colores diferentes: amarillo para aquellas células que se integraron en el primordio cerca de P4, verde para aquellas que estaban en el IPR y morado para aquellas que participaron en ambos procesos (Fig. 7a–c). En t0 (0 h), 1–2 capas de células IPR fueron visibles delante de P4 (Fig. 7a). Como era de esperar, cuando estas células se dividieron, lo hicieron principalmente a través del plano de división transversal (Figs. 7a-c). Se obtuvieron resultados similares utilizando Col-0 SAM (centrándose en P3, cuyo borde se pliega de forma similar a P4 en Ler), aunque en este genotipo el pliegue formado en el borde floral ocultó las células IPR con mayor rapidez (Figs. 7g-i). Por lo tanto, el patrón de división de las células IPR preorganiza las células en filas radiales, como en los entrenudos. La organización de las filas radiales y la localización de las células IPR entre órganos sucesivos sugieren que estas células son progenitoras internodales.
En este estudio, desarrollamos un biosensor de señalización de GA raciométrico, qmRGA, que permite el mapeo cuantitativo de la actividad de señalización de GA resultante de las concentraciones combinadas de GA y receptor de GA, a la vez que minimiza la interferencia con las vías de señalización endógenas, proporcionando así información sobre la función de GA a nivel celular. Para ello, construimos una proteína DELLA modificada, mRGA, que ha perdido la capacidad de unirse a los socios de interacción de DELLA, pero sigue siendo sensible a la proteólisis inducida por GA. qmRGA responde tanto a cambios exógenos como endógenos en los niveles de GA, y sus propiedades de detección dinámica permiten la evaluación de los cambios espaciotemporales en la actividad de señalización de GA durante el desarrollo. qmRGA también es una herramienta muy flexible, ya que puede adaptarse a diferentes tejidos modificando el promotor utilizado para su expresión (si es necesario). Dada la naturaleza conservada de la vía de señalización de GA y el motivo PFYRE en angiospermas, es probable que sea transferible a otras especies22. En consonancia con esto, también se demostró que una mutación equivalente en la proteína DELLA SLR1 del arroz (HYY497AAA) suprimía la actividad represora del crecimiento de SLR1, a la vez que reducía solo ligeramente su degradación mediada por GA, de forma similar a mRGA23. En particular, estudios recientes en Arabidopsis demostraron que una única mutación de aminoácidos en el dominio PFYRE (S474L) alteraba la actividad transcripcional de RGA sin afectar su capacidad de interactuar con factores de transcripción asociados50. Aunque esta mutación es muy similar a las 3 sustituciones de aminoácidos presentes en mRGA, nuestros estudios muestran que estas dos mutaciones alteran características distintivas de DELLA. Aunque la mayoría de los factores de transcripción asociados se unen a los dominios LHR1 y SAW de DELLA26,51, algunos aminoácidos conservados en el dominio PFYRE pueden ayudar a estabilizar estas interacciones.
El desarrollo de los entrenudos es un rasgo clave en la arquitectura de la planta y la mejora del rendimiento. qmRGA reveló una mayor actividad de señalización de GA en las células progenitoras de entrenudos de IPR. Mediante la combinación de imágenes cuantitativas y genética, demostramos que los patrones de señalización de GA superponen los planos de división celular circulares/transversales en la epidermis de SAM, dando forma a la organización de la división celular necesaria para el desarrollo de los entrenudos. Se han identificado varios reguladores de la orientación del plano de división celular durante el desarrollo52,53. Nuestro trabajo proporciona un claro ejemplo de cómo la actividad de señalización de GA regula este parámetro celular. DELLA puede interactuar con complejos proteicos de preplegamiento41, por lo que la señalización de GA puede regular la orientación del plano de división celular al influir directamente en la orientación de los microtúbulos corticales40,41,54,55. De forma inesperada, demostramos que en SAM, el correlato de una mayor actividad de señalización de GA no fue la elongación o la división celular, sino solo la anisotropía del crecimiento, lo cual es coherente con un efecto directo de GA en la dirección de la división celular en el IPR. Sin embargo, no podemos excluir que este efecto también pueda ser indirecto, por ejemplo mediado por el ablandamiento de la pared celular inducido por GA56. Los cambios en las propiedades de la pared celular inducen estrés mecánico57,58, que también puede influir en la orientación del plano de división celular al afectar la orientación de los microtúbulos corticales39,46,59. Los efectos combinados del estrés mecánico inducido por GA y la regulación directa de la orientación de los microtúbulos por GA pueden estar involucrados en la generación de un patrón específico de orientación de la división celular en el IPR para definir los entrenudos, y se necesitan más estudios para probar esta idea. De manera similar, estudios previos han resaltado la importancia de las proteínas interactuantes con DELLA TCP14 y 15 en el control de la formación de los entrenudos60,61 y estos factores pueden mediar la acción de GA junto con BREVIPEDICELLUS (BP) y PENNYWISE (PNY), que regulan el desarrollo de los entrenudos y se ha demostrado que influyen en la señalización de GA2,62. Dado que los DELLA interactúan con las vías de señalización de brasinoesteroides, etileno, ácido jasmónico y ácido abscísico (ABA)63,64 y que estas hormonas pueden influir en la orientación de los microtúbulos65, los efectos de GA en la orientación de la división celular también pueden estar mediados por otras hormonas.
Estudios citológicos tempranos demostraron que tanto las regiones internas como las externas del SAM de Arabidopsis son necesarias para el desarrollo de los entrenudos2,42. El hecho de que el GA regule activamente la división celular en los tejidos internos12 respalda su doble función: regular el tamaño del meristemo y del entrenudo en el SAM. El patrón de división celular direccional también está estrechamente regulado en el tejido del SAM interno, y esta regulación es esencial para el crecimiento del tallo52. Será interesante examinar si el GA también influye en la orientación del plano de división celular en la organización del SAM interno, sincronizando así la especificación y el desarrollo de los entrenudos dentro del SAM.
Las plantas se cultivaron in vitro en suelo o en medio Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) suplementado con 1 % de sacarosa y 1 % de agar (Sigma) en condiciones estándar (16 h de luz, 22 °C), excepto en los experimentos de crecimiento de hipocótilo y raíz, en los que las plántulas se cultivaron en placas verticales con luz constante y 22 °C. Para los experimentos de nitrato, las plantas se cultivaron en medio MS modificado (medio vegetal bioWORLD) suplementado con una cantidad adecuada de nitrato (0 o 10 mM de KNO₃), 0,5 mM de NH₃-succinato, 1 % de sacarosa y 1 % de agar A (Sigma) en condiciones de día largo.
El ADNc de GID1a insertado en pDONR221 se recombinó con pDONR P4-P1R-pUBQ10 y pDONR P2R-P3-mCherry en pB7m34GW para generar pUBQ10::GID1a-mCherry. El ADN de IDD2 insertado en pDONR221 se recombinó en pB7RWG266 para generar p35S:IDD2-RFP. Para generar pGID1b::2xmTQ2-GID1b, primero se amplificaron un fragmento de 3,9 kb aguas arriba de la región codificante de GID1b y un fragmento de 4,7 kb que contenía el ADNc de GID1b (1,3 kb) y el terminador (3,4 kb) utilizando los cebadores de la Tabla complementaria 3 y luego se insertaron en pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) y pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), respectivamente, y finalmente se recombinaron con pDONR221 2xmTQ268 en el vector diana pGreen 012567 utilizando la clonación Gateway. Para generar pCUC2::LSSmOrange, la secuencia promotora de CUC2 (3229 pb aguas arriba de ATG), seguida de la secuencia codificante de mOrange con desplazamiento de Stokes grande (LSSmOrange)69 con la señal de localización nuclear N7 y el terminador transcripcional NOS, se ensamblaron en el vector de kanamicina pGreen utilizando el sistema de recombinación de 3 fragmentos Gateway (Invitrogen). El vector binario vegetal se introdujo en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens y en hojas de Nicotiana benthamiana mediante el método de infiltración de Agrobacterium y en Arabidopsis thaliana Col-0 mediante el método de inmersión floral, respectivamente. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry y pCLV3::mCherry-NLS qmRGA se aislaron de las progenies F3 y F1 de los respectivos cruces, respectivamente.
La hibridación in situ de ARN se realizó en ápices de brotes de aproximadamente 1 cm de longitud72, que se recolectaron y se fijaron inmediatamente en solución FAA (formaldehído al 3,7 %, ácido acético al 5 %, etanol al 50 %), preenfriada a 4 °C. Tras dos tratamientos de vacío de 15 min, se cambió el fijador y las muestras se incubaron durante la noche. Los ADNc de GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 y RGL3, así como las sondas antisentido para sus UTR 3', se sintetizaron utilizando los cebadores que se muestran en la Tabla Suplementaria 3, según lo descrito por Rosier et al.73. Las sondas marcadas con digoxigenina se inmunodetectaron utilizando anticuerpos contra digoxigenina (dilución de 3000 veces; Roche, número de catálogo: 11 093 274 910) y las secciones se tiñeron con una solución de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP, dilución de 250 veces)/nitroazul de tetrazolio (NBT, dilución de 200 veces).