El fármaco antihelmíntico N,N-dietil-m-toluamida (DEETSe ha reportado que el DEET inhibe la acetilcolinesterasa (ACE) y posee propiedades carcinogénicas potenciales debido a la vascularización excesiva. En este artículo, demostramos que el DEET estimula específicamente las células endoteliales que promueven la angiogénesis, incrementando así el crecimiento tumoral. El DEET activa los procesos celulares que conducen a la angiogénesis, incluyendo la proliferación, migración y adhesión. Esto se asocia con un aumento en la producción de NO y la expresión de VEGF en las células endoteliales. El silenciamiento de M3 o el uso de inhibidores farmacológicos de M3 eliminaron todos estos efectos, lo que sugiere que la angiogénesis inducida por DEET es sensible a M3. Experimentos que involucran la señalización de calcio en células endoteliales y HEK que sobreexpresan receptores M3, así como estudios de unión y acoplamiento, indican que el DEET actúa como un modulador alostérico de los receptores M3. Además, el DEET inhibe la AChE, incrementando así la biodisponibilidad de la acetilcolina y su unión a los receptores M3, y potenciando los efectos proangiogénicos mediante la regulación alostérica.
Las CE primarias se aislaron de la aorta de ratones suizos. El método de extracción se adaptó del protocolo Kobayashi 26. Las CE murinas se cultivaron en medio EBM-2 suplementado con 5 % de FBS inactivado por calor hasta el cuarto pase.
Se analizó el efecto de dos concentraciones de DEET sobre la proliferación de HUVEC, U87MG o BF16F10 con el kit de ensayo de proliferación celular CyQUANT (Molecular Probes, C7026). En resumen, se sembraron 5,10³ células por pocillo en una placa de 96 pocillos, se dejaron adherir durante la noche y se trataron con DEET durante 24 h. Tras retirar el medio de cultivo, se añadió solución fijadora de colorante a cada pocillo de la microplaca y se incubaron las células a 37 °C durante 30 min. Los niveles de fluorescencia se determinaron con un lector de microplacas multimodo Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania), equipado con filtros de excitación de 485 nm y filtros de emisión de 530 nm.
Las células HUVEC se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10⁻¹ células por pocillo. Las células se trataron con DEET durante 24 h. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo colorimétrico MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Los valores de densidad óptica se obtuvieron en un lector de microplacas multimodo (Mithras LB940) a una longitud de onda de 570 nm.
Los efectos del DEET se estudiaron mediante ensayos de angiogénesis in vitro. El tratamiento con DEET 10⁻¹⁶ o 10⁻¹⁶ M aumentó la formación de capilares en HUVEC (Fig. 1a, b, barras blancas). En comparación con el grupo control, el tratamiento con concentraciones de DEET de 10⁻¹⁶ a 10⁻¹⁶ M mostró que la longitud capilar se estabilizó con 10⁻¹⁶ M (Fig. S2 suplementaria). No se observaron diferencias significativas en el efecto proangiogénico in vitro de las HUVEC tratadas con DEET en el rango de concentración de 10⁻¹⁶ y 10⁻¹⁶ M.
Para determinar el efecto del DEET sobre la neovascularización, realizamos estudios de neovascularización in vivo. Tras 14 días, los ratones inyectados con células endoteliales precultivadas con DEET 10⁻¹ M o 10⁻¹ M mostraron un aumento significativo del contenido de hemoglobina (Fig. 1c, barras blancas).
Además, se estudió la neovascularización inducida por DEET en ratones portadores de xenoinjerto U87MG a los que se les inyectó DEET diariamente (ip) en una dosis conocida por inducir concentraciones plasmáticas de 10-5 M, lo cual es normal en humanos expuestos. en 23. Se observaron tumores detectables (es decir, tumores >100 mm³) 14 días después de la inyección de células U87MG en ratones. El día 28, el crecimiento tumoral aumentó significativamente en los ratones tratados con DEET en comparación con los ratones control (Fig. 1d, cuadrados). Además, la tinción de CD31 de los tumores mostró que DEET aumentó significativamente el área capilar, pero no la densidad de microvasos. (Fig. 1e–g).
Para determinar la función de los receptores muscarínicos en la proliferación inducida por DETA, se utilizó DETA 10⁻¹⁶ M o 10⁻¹⁶ M en presencia de pFHHSiD (10⁻¹⁶ M, un antagonista selectivo del receptor M3). El tratamiento de HUVEC con pFHHSiD bloqueó completamente las propiedades proliferativas de DETA en todas las concentraciones (Tabla 1).
En estas condiciones, también examinamos si el DEET aumentaría la longitud capilar en las células HUVEC. De igual forma, pFHHSiD previno significativamente la longitud capilar inducida por DEET (Fig. 1a, b, barras grises). Además, se realizaron experimentos similares con el ARNip M3. Aunque el ARNip de control no fue eficaz para promover la formación de capilares, el silenciamiento del receptor muscarínico M3 anuló la capacidad del DEET para aumentar la longitud capilar (Fig. 1a, b, barras negras).
Además, tanto la vascularización inducida por DEET 10⁻¹⁶ o 10⁻¹⁶ M como la neovascularización in vivo fueron bloqueadas completamente por pFHHSiD (Fig. 1c, d, círculos). Estos resultados indican que el DEET promueve la angiogénesis a través de una vía sensible a antagonistas selectivos del receptor M3 o a ARNi de M3.
La AChE es la diana molecular del DEET. Fármacos como el donepezilo, que actúan como inhibidores de la AChE, pueden estimular la angiogénesis de las células endoteliales (CE) in vitro y en modelos murinos de isquemia de las extremidades posteriores14. Se evaluó el efecto de dos concentraciones de DEET sobre la actividad enzimática de la AChE en las CEVHU. Concentraciones bajas (10-8 M) y altas (10-5 M) de DEET disminuyeron la actividad de la AChE endotelial en comparación con las condiciones control (Fig. 2).
Ambas concentraciones de DEET (10-8 M y 10-5 M) redujeron la actividad de la acetilcolinesterasa en HUVEC. BW284c51 (10-5 M) se utilizó como control para los inhibidores de la acetilcolinesterasa. Los resultados se expresan como porcentaje de la actividad de AChE en HUVEC tratadas con las dos concentraciones de DEET en comparación con las células tratadas con el vehículo. Los valores se expresan como media ± EEM de seis experimentos independientes. *p < 0,05 en comparación con el control (prueba de comparación múltiple de Kruskal-Wallis y Dunn).
El óxido nítrico (NO) está involucrado en el proceso angiogénico 33, por lo tanto, se estudió la producción de NO en HUVEC estimuladas con DEET. La producción de NO endotelial tratada con DEET aumentó en comparación con las células control, pero alcanzó la significación solo a una dosis de 10-8 M (Fig. 3c). Para determinar los cambios moleculares que controlan la producción de NO inducida por DEET, se analizó la expresión y activación de eNOS mediante Western blotting. Aunque el tratamiento con DEET no alteró la expresión de eNOS, aumentó significativamente la fosforilación de eNOS en su sitio activador (Ser-1177) mientras que disminuyó su sitio inhibidor (Thr-495) en comparación con las células no tratadas en la fosforilación de eNOS (Fig. 3d). Además, la proporción de eNOS fosforilada en el sitio de activación y el sitio inhibidor se calculó después de normalizar la cantidad de eNOS fosforilada a la cantidad total de enzima. Esta proporción aumentó significativamente en HUVEC tratadas con cada concentración de DEET en comparación con las células no tratadas (Fig. 3d).
Finalmente, se analizó la expresión de VEGF, uno de los principales factores proangiogénicos, mediante Western blot. El DEET aumentó significativamente la expresión de VEGF, mientras que pFHHSiD la bloqueó por completo.
Dado que los efectos del DEET son sensibles tanto al bloqueo farmacológico como a la regulación negativa de los receptores M3, evaluamos la hipótesis de que el DEET podría potenciar la señalización del calcio. Sorprendentemente, el DEET no aumentó el calcio citoplasmático en HUVEC (datos no mostrados) ni en HEK/M3 (Fig. 4a, b) en ambas concentraciones utilizadas.
Hora de publicación: 30 de diciembre de 2024