El fármaco antihelmíntico N,N-dietil-m-toluamida (DEETSe ha informado que el DEET inhibe la AChE (acetilcolinesterasa) y tiene potenciales propiedades carcinogénicas debido a la vascularización excesiva. En este trabajo, mostramos que el DEET estimula específicamente las células endoteliales que promueven la angiogénesis, aumentando así el crecimiento tumoral. El DEET activa procesos celulares que conducen a la angiogénesis, incluyendo proliferación, migración y adhesión. Esto se asocia con un aumento en la producción de NO y la expresión de VEGF en las células endoteliales. El silenciamiento de M3 o el uso de inhibidores farmacológicos de M3 abolieron todos estos efectos, lo que sugiere que la angiogénesis inducida por DEET es sensible a M3. Experimentos que involucran la señalización de calcio en células endoteliales y HEK que sobreexpresan receptores M3, así como estudios de unión y acoplamiento, indican que el DEET actúa como un modulador alostérico de los receptores M3. Además, el DEET inhibe la AChE, aumentando así la biodisponibilidad de acetilcolina y su unión a los receptores M3, y potenciando los efectos proangiogénicos a través de la regulación alostérica.
Se aislaron células endoteliales primarias de la aorta de ratones suizos. El método de extracción se adaptó del protocolo de Kobayashi 26. Las células endoteliales murinas se cultivaron en medio EBM-2 suplementado con 5 % de suero fetal bovino inactivado por calor hasta el cuarto pase.
Se analizó el efecto de dos concentraciones de DEET en la proliferación de HUVEC, U87MG o BF16F10 utilizando el kit de ensayo de proliferación celular CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Brevemente, se sembraron 5 × 10³ células por pocillo en una placa de 96 pocillos, se dejaron adherir durante la noche y luego se trataron con DEET durante 24 h. Tras retirar el medio de cultivo, se añadió la solución de unión del colorante a cada pocillo de la microplaca y se incubaron las células a 37 °C durante 30 min. Los niveles de fluorescencia se determinaron utilizando un lector de microplacas multimodo Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania) equipado con filtros de excitación de 485 nm y filtros de emisión de 530 nm.
Las células HUVEC se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 10⁴ células por pocillo. Las células se trataron con DEET durante 24 horas. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo colorimétrico MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Los valores de densidad óptica se obtuvieron en un lector de microplacas multimodo (Mithras LB940) a una longitud de onda de 570 nm.
Se estudiaron los efectos del DEET mediante ensayos de angiogénesis in vitro. El tratamiento con 10⁻⁸ M o 10⁻⁵ M de DEET aumentó la longitud de los capilares en las HUVEC (Fig. 1a, b, barras blancas). En comparación con el grupo control, el tratamiento con concentraciones de DEET entre 10⁻¹⁴ y 10⁻⁵ M mostró que la longitud de los capilares se estabilizó a 10⁻⁸ M de DEET (Fig. S2 complementaria). No se observaron diferencias significativas en el efecto proangiogénico in vitro de las HUVEC tratadas con DEET en el rango de concentración de 10⁻⁸ M y 10⁻⁵ M.
Para determinar el efecto del DEET sobre la neovascularización, realizamos estudios de neovascularización in vivo. Después de 14 días, los ratones a los que se les inyectaron células endoteliales precultivadas con 10⁻⁸ M o 10⁻⁵ M de DEET mostraron un aumento significativo en el contenido de hemoglobina (Fig. 1c, barras blancas).
Además, se estudió la neovascularización inducida por DEET en ratones portadores de xenoinjertos U87MG a los que se les inyectó diariamente (ip) DEET a una dosis conocida por inducir concentraciones plasmáticas de 10-5 M, que es normal en humanos expuestos. en 23. Se observaron tumores detectables (es decir, tumores >100 mm3) 14 días después de la inyección de células U87MG en ratones. En el día 28, el crecimiento tumoral fue significativamente mayor en los ratones tratados con DEET en comparación con los ratones control (Fig. 1d, cuadrados). Además, la tinción de CD31 de los tumores mostró que el DEET aumentó significativamente el área capilar pero no la densidad de microvasos. (Fig. 1e–g).
Para determinar el papel de los receptores muscarínicos en la proliferación inducida por DETA, se utilizó DETA a concentraciones de 10⁻⁸ M o 10⁻⁵ M en presencia de pFHHSiD (10⁻⁷ M, un antagonista selectivo del receptor M3). El tratamiento de HUVEC con pFHHSiD bloqueó completamente las propiedades proliferativas de DETA en todas las concentraciones (Tabla 1).
En estas condiciones, también examinamos si el DEET aumentaría la longitud capilar en células HUVEC. De manera similar, pFHHSiD previno significativamente el aumento de la longitud capilar inducido por DEET (Fig. 1a, b, barras grises). Además, se realizaron experimentos similares con siRNA M3. Si bien el siRNA de control no fue efectivo para promover la formación de capilares, el silenciamiento del receptor muscarínico M3 eliminó la capacidad del DEET para aumentar la longitud capilar (Fig. 1a, b, barras negras).
Además, tanto la vascularización in vitro inducida por DEET a concentraciones de 10⁻⁸ M como de 10⁻⁵ M, así como la neovascularización in vivo, fueron completamente bloqueadas por pFHHSiD (Fig. 1c, d, círculos). Estos resultados indican que el DEET promueve la angiogénesis a través de una vía sensible a los antagonistas selectivos del receptor M3 o al siRNA M3.
La AChE es la diana molecular del DEET. Fármacos como el donepezilo, que actúan como inhibidores de la AChE, pueden estimular la angiogénesis de las células endoteliales in vitro y en modelos de isquemia de las extremidades posteriores de ratones14. Probamos el efecto de dos concentraciones de DEET sobre la actividad de la enzima AChE en HUVEC. Las concentraciones bajas (10⁻⁸ M) y altas (10⁻⁵ M) de DEET disminuyeron la actividad de la AChE endotelial en comparación con las condiciones de control (Fig. 2).
Ambas concentraciones de DEET (10⁻⁸ M y 10⁻⁵ M) redujeron la actividad de la acetilcolinesterasa en HUVEC. Se utilizó BW284c51 (10⁻⁵ M) como control para los inhibidores de la acetilcolinesterasa. Los resultados se expresan como porcentaje de la actividad de la AChE en HUVEC tratadas con las dos concentraciones de DEET en comparación con las células tratadas con el vehículo. Los valores se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) de seis experimentos independientes. *p < 0,05 en comparación con el control (prueba de Kruskal-Wallis y prueba de comparaciones múltiples de Dunn).
El óxido nítrico (NO) participa en el proceso angiogénico 33, por lo tanto, se estudió la producción de NO en HUVEC estimuladas con DEET. La producción de NO endotelial tratada con DEET aumentó en comparación con las células control, pero solo alcanzó significancia a una dosis de 10-8 M (Fig. 3c). Para determinar los cambios moleculares que controlan la producción de NO inducida por DEET, se analizó la expresión y activación de eNOS mediante Western blot. Aunque el tratamiento con DEET no alteró la expresión de eNOS, aumentó significativamente la fosforilación de eNOS en su sitio activador (Ser-1177) mientras disminuyó su sitio inhibidor (Thr-495) en comparación con las células no tratadas en la fosforilación de eNOS (Fig. 3d). Además, se calculó la relación de eNOS fosforilada en el sitio activador y el sitio inhibidor después de normalizar la cantidad de eNOS fosforilada a la cantidad total de enzima. Esta relación aumentó significativamente en HUVEC tratadas con cada concentración de DEET en comparación con las células no tratadas (Fig. 3d).
Finalmente, se analizó la expresión de VEGF, uno de los principales factores proangiogénicos, mediante Western blotting. El DEET aumentó significativamente la expresión de VEGF, mientras que el pFHHSiD la bloqueó por completo.
Dado que los efectos del DEET son sensibles tanto al bloqueo farmacológico como a la regulación negativa de los receptores M3, pusimos a prueba la hipótesis de que el DEET podría potenciar la señalización del calcio. Sorprendentemente, el DEET no logró aumentar el calcio citoplasmático en HUVEC (datos no mostrados) ni en HEK/M3 (Fig. 4a, b) para ninguna de las concentraciones utilizadas.
Hora de publicación: 30 de diciembre de 2024