Gracias por visitar Nature.com. La versión del navegador que está utilizando tiene soporte CSS limitado. Para obtener mejores resultados, le recomendamos que utilice una versión más reciente de su navegador (o deshabilite el Modo de compatibilidad en Internet Explorer). Mientras tanto, para garantizar un soporte continuo, mostramos el sitio sin estilo ni JavaScript.
El descubrimiento y uso beneficioso de productos naturales puede ayudar a mejorar la vida humana. Los productos químicos inhibidores del crecimiento de las plantas se utilizan ampliamente como herbicidas para controlar las malas hierbas. Debido a la necesidad de utilizar diferentes tipos de herbicidas, surge la necesidad de identificar compuestos con nuevos mecanismos de acción. En este estudio, descubrimos un nuevo compuesto de N -alcoxipirrol, la coumamonamida, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 y establecimos el proceso de síntesis completo. A través de ensayos de actividad biológica, descubrimos que el ácido urs-monoámico es un intermedio sintético de la urs-monoamida y un potencialinhibidor del crecimiento de las plantas. Además, hemos desarrollado varios derivados del ácido urbenónico, incluido el derivado urbeniloxi (UDA), que tiene una alta actividad herbicida sin afectar negativamente al crecimiento de las células HeLa. También encontramos que los derivados del ácido urmotonico alteran los microtúbulos de las plantas; además, KAND afecta los filamentos de actina e induce la muerte celular; Estos efectos multifacéticos difieren de los de los inhibidores de microtúbulos conocidos y sugieren un nuevo mecanismo de acción para el ácido ursónico, que representa una ventaja importante en el desarrollo de nuevos herbicidas.
El descubrimiento y la aplicación práctica de productos naturales beneficiosos y sus derivados es un medio para mejorar la calidad de vida humana. Los metabolitos secundarios producidos por microorganismos, plantas e insectos han dado lugar a importantes avances en la medicina y la agricultura. Se han desarrollado muchos antibióticos y medicamentos contra la leucemia a partir de productos naturales. Además, diversos tipos depesticidasDe estos productos naturales se extraen fungicidas y herbicidas para su uso en agricultura. En particular, los herbicidas para el control de malezas son herramientas importantes para aumentar el rendimiento de los cultivos en la agricultura moderna, y ya se utilizan comercialmente varios tipos de compuestos. Varios procesos celulares en las plantas, como la fotosíntesis, el metabolismo de los aminoácidos, la síntesis de la pared celular, la regulación de la mitosis, la señalización de fitohormonas o la síntesis de proteínas, se consideran objetivos típicos de los herbicidas. Los compuestos que inhiben la función de los microtúbulos son una clase común de herbicidas que afectan el crecimiento de las plantas al afectar la regulación mitótica2.
Los microtúbulos son componentes del citoesqueleto y están ampliamente conservados en las células eucariotas. El heterodímero de tubulina consta de α-tubulina y β-tubulina que forman protofilamentos de microtúbulos lineales, con 13 protofilamentos que forman una estructura cilíndrica. Los microtúbulos desempeñan múltiples funciones en las células vegetales, incluida la determinación de la forma celular, la división celular y el transporte intracelular3,4. Las células vegetales contienen microtúbulos debajo de la membrana plasmática en interfase, y se cree que estos llamados microtúbulos corticales controlan la organización de las microfibrillas de celulosa mediante la regulación de los complejos de celulosa sintasa4,5. Los microtúbulos corticales de las células epidérmicas de la raíz, presentes en la zona de rápida elongación de la punta de la raíz, están ubicados lateralmente, y las microfibras de celulosa siguen a estos microtúbulos y limitan la dirección de expansión celular, promoviendo así el alargamiento anisotrópico de las células. Por tanto, la función de los microtúbulos está estrechamente relacionada con la morfología de las plantas. Las sustituciones de aminoácidos en los genes que codifican la tubulina provocan una desviación de las matrices de microtúbulos corticales y un crecimiento del lado izquierdo o derecho en Arabidopsis 6,7. De manera similar, las mutaciones en las proteínas asociadas a los microtúbulos que regulan la dinámica de los microtúbulos también pueden provocar un crecimiento distorsionado de las raíces8,9,10,11,12,13. Además, el tratamiento con herbicidas que alteran los microtúbulos, como la disopiramida, también conocida como pretilaclor, también provoca el crecimiento de las raíces oblicuas hacia la izquierda14. Estos datos indican que la regulación precisa de la función de los microtúbulos es fundamental para determinar la dirección del crecimiento de las plantas.
Se han descubierto varios tipos de inhibidores de microtúbulos y estos fármacos han realizado importantes contribuciones a la investigación del citoesqueleto, así como a la agricultura y la medicina2. En particular, la orizalina, los compuestos de dinitroanilina, la disopiramida, los compuestos relacionados con la benzamida y sus análogos pueden inhibir la función de los microtúbulos y, por tanto, inhibir el crecimiento de las plantas. Por tanto, se utilizan mucho como herbicidas. Sin embargo, dado que los microtúbulos son un componente importante de las células vegetales y animales, la mayoría de los inhibidores de microtúbulos son citotóxicos para ambos tipos de células. Por lo tanto, a pesar de su reconocida utilidad como herbicidas, con fines prácticos se utiliza un número limitado de agentes antimicrotúbulos.
Streptomyces es un género de la familia Streptomyces, que incluye bacterias filamentosas, grampositivas y aeróbicas y es ampliamente conocido por su capacidad para producir una amplia gama de metabolitos secundarios. Por ello, se considera una de las fuentes más importantes de nuevos productos naturales biológicamente activos. En el estudio actual, descubrimos un nuevo compuesto llamado coumamonamida, que se aisló de Streptomyces werraensis MK493-CF1 y S. werraensis ISP 5486. Utilizando análisis espectral y análisis espectral completo, se caracterizó la estructura de la coumamonamida y su esqueleto único de N-alcoxipirrol. estaba determinado. síntesis. Se descubrió que el ácido ursmónico, un intermedio sintético de la ursmonoamida y sus derivados, inhibe el crecimiento y la germinación de la popular planta modelo Arabidopsis thaliana. En un estudio de relación estructura-actividad, encontramos que un compuesto con C9 modificado a ácido ursónico, llamado noniloxi derivado del ácido ursónico (KAND), mejora significativamente el efecto inhibidor sobre el crecimiento y la germinación. En particular, el inhibidor del crecimiento vegetal recientemente descubierto también afectó el crecimiento del tabaco y la hepática y no fue citotóxico para las bacterias ni las células HeLa. Además, algunos derivados del ácido urmotonico inducen un fenotipo de raíz distorsionado, lo que implica que estos derivados afectan directa o indirectamente a los microtúbulos. De acuerdo con esta idea, nuestras observaciones de microtúbulos marcados inmunohistoquímicamente o con proteínas fluorescentes indican que el tratamiento con KAND despolimeriza los microtúbulos. Además, el tratamiento con derivados del ácido kumamotonico alteró los microfilamentos de actina. Así, hemos descubierto un nuevo inhibidor del crecimiento vegetal cuyo mecanismo de acción único implica la destrucción del citoesqueleto.
La cepa MK493-CF1 se aisló del suelo en Shinagawa-ku, Tokio. La cepa MK493-CF1 formó micelio estromal bien ramificado. Se determinó la secuencia parcial del gen del ARN ribosómico 16S (1422 pb). Esta cepa es muy similar a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: cepa típica, 99,93%). Con base en este resultado, se determinó que esta cepa estaba estrechamente relacionada con la cepa tipo de S. werraensis. Por lo tanto, denominamos provisionalmente a esta cepa S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T también produce los mismos compuestos bioactivos. Dado que hubo pocas investigaciones iniciales sobre la obtención de productos naturales a partir de este microorganismo, se llevaron a cabo más investigaciones químicas. Después del cultivo de S. werraensis MK493-CF1 en medio de cebada mediante fermentación en estado sólido a 30°C durante 14 días, el medio se extrajo con EtOH al 50%. Se secaron 60 ml de muestra para obtener 59,5 mg de extracto crudo. El extracto bruto se sometió a HPLC de fase inversa para dar N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida (1, denominada coumamonamida, 36,0 mg). La cantidad total de 1 es aproximadamente el 60% del extracto crudo. Por ello, decidimos estudiar en detalle las propiedades de la kumamotoamida 1.
La cumamonamida 1 es un polvo amorfo blanco y la espectrometría de masas de alta resolución (HRESIMS) confirma C6H8N2O2 (Fig. 1). El fragmento de pirrol sustituido en C2 de este compuesto se caracteriza por δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH en espectro de RMN 1H: 4,5 Hz , H-5) y δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), y el espectro de RMN de 13C muestra la presencia de cuatro átomos de carbono sp2. La presencia de un grupo amida en la posición C2 se evaluó mediante correlación HMBC del protón C-3 al carbono carbonilo amida en δC 161,1. Además, los picos de RMN de 1 H y 13 C en δH 4,10 (3H, S) y δC 68,3 indican la presencia de grupos N-metoxi en la molécula. Aunque aún no se había determinado la posición correcta del grupo metoxi mediante análisis espectroscópicos como la espectroscopia de diferencias mejoradas y la abreviatura nuclear de Overhauser (NOEDF), la N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida se convirtió en el primer compuesto candidato.
Para determinar la estructura correcta de 1, se realizó una síntesis total (Fig. 2a). El tratamiento de 2-aminopiridina 2 disponible comercialmente con m-CPBA dio como resultado el correspondiente N-óxido 3 con rendimiento cuantitativo. Después de la 2-aminoazidación de 2, se llevó a cabo la reacción de ciclocondensación descrita por Abramovich en benceno a 90°C para obtener el 1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitrilo deseado, 5 en gramos. Velocidad 60% (dos etapas). 15,16. Luego, la metilación y la hidrólisis de 4 dieron ácido 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílico (denominado “ácido cumotónico”, 6) con buen rendimiento (70 %, dos etapas). Finalmente, la amidación mediante cloruro de ácido intermedio 6 usando amoníaco acuoso dio la amida de Kumamoto 1 con un rendimiento del 98 %. Todos los datos espectrales de 1 sintetizado fueron similares a los de 1 aislado, por lo que se determinó la estructura de 1;
Síntesis general y análisis de la actividad biológica de urbenamida y ácido urbénico. ( a ) Síntesis total de amida de Kumamoto. ( b ) Se cultivaron plántulas de Arabidopsis Columbia (Col) de tipo salvaje de siete días en placas Murashige y Skoog (MS) que contenían coumamonamida 6 o coumamonamida 1 en las concentraciones indicadas. Barra de escala = 1 cm.
Primero, evaluamos las actividades biológicas de la urbenamida y sus intermedios por su capacidad para modular el crecimiento de las plantas. Agregamos varias concentraciones de ursmonamida 1 o ácido ursmónico 6 al medio agar MS y cultivamos plántulas de Arabidopsis thaliana en este medio. Estos ensayos mostraron que altas concentraciones (500 μM) de 6 inhibieron el crecimiento de las raíces (Fig. 2b). A continuación, generamos varios derivados sustituyendo la posición N1 de 6 y realizamos estudios de relación estructura-actividad sobre ellos (el proceso de síntesis analógica se describe en la Información de respaldo (SI)). Las plántulas de Arabidopsis se cultivaron en un medio que contenía derivados de ácido ursónico 50 µM y se midió la longitud de las raíces. Como se muestra en la imagen. Como se muestra en las Figuras 3a, b y S1, los ácidos cumamo tienen diferentes longitudes de cadenas alcoxi lineales (9, 10, 11, 12 y 13) o cadenas alcoxi grandes (15, 16 y 17) en la posición N1. Los derivados mostraron una inhibición significativa del crecimiento de las raíces. Además, encontramos que la aplicación de 200 μM 10, 11 o 17 inhibió la germinación (Figs. 3c y S2).
Estudio de la relación estructura-actividad de la amida de Kumamoto y compuestos relacionados. (a) Estructura y esquema de síntesis de análogos. (b) Cuantificación de la longitud de la raíz de plántulas de 7 días cultivadas en medio MS con o sin derivados de cumamonamida 50 μM. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba t, p< 0,05). n>18. Los datos se muestran como media ± DE. nt significa “no probado” porque más del 50% de las semillas no germinaron. (c) Cuantificación de la tasa de germinación de semillas tratadas incubadas durante 7 días en medio MS con o sin coumamonamida 200 μM y compuestos relacionados. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba de chi-cuadrado). n=96.
Curiosamente, la adición de cadenas laterales de alquilo más largas que C9 redujo la actividad inhibidora, lo que sugiere que los compuestos relacionados con el ácido kumamotoico requieren cadenas laterales de cierto tamaño para exhibir su actividad biológica.
Debido a que el análisis de la relación estructura-actividad mostró que C9 se modificó a ácido ursónico y que el derivado noniloxi del ácido ursónico (en adelante denominado KAND 11) era el inhibidor del crecimiento vegetal más eficaz, realizamos una caracterización más detallada de KAND 11. Tratamiento de Arabidopsis con 50 μM KAND 11 impidió casi por completo la germinación, mientras que concentraciones más bajas (40, 30, 20 o 10 μM) de KAND 11 inhibieron crecimiento de las raíces de manera dependiente de la dosis (Fig. 4a, b). Para probar si KAND 11 afecta la viabilidad del meristemo de la raíz, examinamos los meristemos de la raíz teñidos con yoduro de propidio (PI) y medimos el tamaño del área del meristemo. El tamaño del meristemo de las plántulas cultivadas en un medio que contenía KAND-11 25 μM fue de 151,1 ± 32,5 μm, mientras que el tamaño del meristemo de las plántulas cultivadas en un medio de control que contenía DMSO fue de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d). , lo que indica que KAND-11 restaura la actividad celular. extensión. Meristemo de raíz. De acuerdo con esto, el tratamiento con KAND 11 redujo la cantidad de señal del marcador de división celular CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS en el meristemo de la raíz (Fig. 4e) 17. Estos resultados indican que KAND 11 inhibe el crecimiento de las raíces al reducir la actividad de proliferación celular.
Análisis del efecto inhibidor de los derivados del ácido urbenónico (derivados urbeniloxi) sobre el crecimiento. (a) Plántulas de Col de tipo salvaje de 7 días cultivadas en placas MS con las concentraciones indicadas de KAND 11. Barra de escala = 1 cm. (b) Cuantificación de la longitud de la raíz. Las letras indican diferencias significativas (prueba Tukey HSD, p< 0,05). n>16. Los datos se muestran como media ± DE. (c) Microscopía confocal de raíces Col de tipo salvaje teñidas con yoduro de propidio cultivadas en placas MS con o sin KAND 11 25 μM. Los corchetes blancos indican el meristemo de la raíz. Barra de escala = 100 µm. (d) Cuantificación del tamaño del meristemo de la raíz (n = 10 a 11). Las diferencias estadísticas se determinaron mediante la prueba t (p< 0,05). Las barras representan el tamaño promedio del meristemo. (e) Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) de un meristemo de raíz que contiene la construcción CDKB2; 1pro: CDKB2; Teñido con 1-GUS y teñido en plántulas de 5 días cultivadas en placas MS con o sin ensayo KAND 25 µM.
La fitotoxicidad de KAND 11 se probó adicionalmente utilizando otra planta dicotiledónea, el tabaco (Nicotiana tabacum), y un importante organismo modelo de planta terrestre, la hepática (Marchantia polymorpha). Como en el caso de Arabidopsis, las plántulas de tabaco SR-1 cultivadas en un medio que contenía KAND 11 25 μM produjeron raíces más cortas (Fig. 5a). Además, 40 de 48 semillas germinaron en placas que contenían KAND 11 200 μM, mientras que las 48 semillas germinaron en medios tratados simuladamente, lo que indica que concentraciones más altas de KAND fueron significativas (p.< 0,05; prueba de chi -cuadrado) inhibió la germinación del tabaco. (Figura 5b). Además, la concentración de KAND 11 que inhibió el crecimiento bacteriano en la hepática fue similar a la concentración efectiva en Arabidopsis (Fig. 5c). Estos resultados indican que KAND 11 puede inhibir el crecimiento de una variedad de plantas. Luego investigamos la posible citotoxicidad de compuestos relacionados con la monoamida de oso en otros organismos, concretamente en células HeLa humanas y en la cepa DH5α de Escherichia coli, como representantes de células animales y bacterianas superiores, respectivamente. En una serie de ensayos de proliferación celular, observamos que la coumamonamida 1, el ácido cumamonamidico 6 y KAND 11 no afectaron el crecimiento de células HeLa o E. coli en concentraciones de 100 μM (Fig. 5d, e).
Inhibición del crecimiento de KAND 11 en organismos que no son Arabidopsis. (a) Se cultivaron plántulas de tabaco SR-1 de tipo salvaje de dos semanas de edad en placas MS colocadas verticalmente que contenían KAND 11 25 µM. (b) Se cultivaron plántulas de tabaco SR-1 de tipo salvaje de dos semanas de edad en placas MS colocadas verticalmente. Placas MS que contienen KAND 11 200 μM. ( c ) Brotes de hepática Tak-1 de tipo salvaje de dos semanas de edad cultivados en placas Gamborg B5 con las concentraciones indicadas de KAND 11. Flechas rojas indican esporas que dejaron de crecer dentro del período de incubación de dos semanas. (d) Ensayo de proliferación celular de células HeLa. El número de células viables se midió a intervalos de tiempo fijos utilizando un kit de recuento de células 8 (Dojindo). Como control, las células HeLa se trataron con 5 μg/ml de actinomicina D (Act D), que inhibe la transcripción de la ARN polimerasa y provoca la muerte celular. Los análisis se realizaron por triplicado. (e) Ensayo de proliferación celular de E. coli. El crecimiento de E. coli se analizó midiendo la DO600. Como control, las células se trataron con 50 μg/ml de ampicilina (Amp), que inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana. Los análisis se realizaron por triplicado.
Para descifrar el mecanismo de acción de la citotoxicidad causada por compuestos relacionados con la uramida, volvimos a analizar derivados del ácido urbénico con efectos inhibidores moderados. Como se muestra en la imagen. Como se muestra en las Figuras 2b, 6a, las plántulas cultivadas en placas de agar que contenían altas concentraciones (200 μM) de ácido urmotonico 6 produjeron raíces más cortas y curvadas hacia la izquierda (θ = – 23,7 ± 6,1), mientras que de las plántulas cultivadas en el medio de control, el las plántulas produjeron raíces casi rectas (θ = – 3,8 ± 7,1). Se sabe que este crecimiento oblicuo característico es el resultado de una disfunción de los microtúbulos corticales14,18. De acuerdo con este hallazgo, los fármacos desestabilizadores de microtúbulos disopiramida y orizalina indujeron una inclinación de la raíz similar en nuestras condiciones de crecimiento (Figs. 2b, 6a). Al mismo tiempo, probamos derivados del ácido urmotonico y seleccionamos varios de ellos que, en determinadas concentraciones, inducían el crecimiento oblicuo de las raíces. Los compuestos 8, 9 y 15 cambiaron la dirección del crecimiento de las raíces a 75 μM, 50 μM y 40 μM, respectivamente, lo que indica que estos compuestos pueden desestabilizar eficazmente los microtúbulos (Fig. 2b, 6a). También probamos el derivado de ácido ursólico más potente, KAND 11, en una concentración más baja (15 µM) y encontramos que la aplicación de KAND 11 inhibía el crecimiento de las raíces y que la dirección del crecimiento de las raíces era desigual, aunque tendían a inclinarse hacia la izquierda ( Figura C3). . Debido a que las concentraciones más altas de fármacos desestabilizadores de microtúbulos a veces inhiben el crecimiento de las plantas en lugar de causar la inclinación de las raíces, posteriormente evaluamos la posibilidad de que KAND 11 afecte a los microtúbulos mediante la observación de los microtúbulos corticales en las células epidérmicas de las raíces. La inmunohistoquímica que utiliza anticuerpos anti-β-tubulina en células epidérmicas de raíces de plántulas tratadas con KAND 11 25 μM mostró la desaparición de casi todos los microtúbulos corticales en las células epidérmicas en la zona de elongación (Fig. 6b). Estos resultados indican que el ácido kumamotonico y sus derivados actúan directa o indirectamente sobre los microtúbulos para alterarlos y que estos compuestos son nuevos inhibidores de microtúbulos.
El ácido ursónico y sus derivados alteran los microtúbulos corticales en Arabidopsis thaliana. (a) Ángulo de inclinación de la raíz medido en presencia de varios derivados del ácido urmotonico en las concentraciones indicadas. También se analizaron los efectos de dos compuestos que se sabe que inhiben los microtúbulos: la disopiramida y la orizalina. El recuadro muestra el estándar utilizado para medir el ángulo de crecimiento de las raíces. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba t, p< 0,05). n>19. Barra de escala = 1 cm. (b) Microtúbulos corticales en células epidérmicas en la zona de elongación. Los microtúbulos en raíces de Arabidopsis Col de tipo salvaje cultivadas en placas MS con o sin KAND 11 25 μM se visualizaron mediante tinción inmunohistoquímica utilizando anticuerpos primarios de β-tubulina y anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor. Barra de escala = 10 µm. (c) Estructura mitótica de los microtúbulos en el meristemo de la raíz. Los microtúbulos se visualizaron mediante tinción inmunohistoquímica. Las estructuras mitóticas, incluidas las zonas de profase, los husos y los fragmoplastos, se contaron a partir de imágenes confocales. Las flechas indican estructuras de microtúbulos mitóticos. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba t, p< 0,05). n>9. Barra de escala = 50 µm.
Aunque Ursa tiene la capacidad de alterar la función de los microtúbulos, se espera que su mecanismo de acción sea diferente al de los agentes despolimerizantes de microtúbulos típicos. Por ejemplo, concentraciones más altas de agentes despolimerizantes de microtúbulos como disopiramida y orizalina inducen una expansión anisotrópica de las células epidérmicas, mientras que KAND 11 no. Además, la aplicación conjunta de KAND 11 y disopiramida dio como resultado una respuesta combinada de crecimiento de raíces inducida por disopiramida y se observó una inhibición del crecimiento inducida por KAND 11 (Fig. S4). También analizamos la respuesta del mutante hipersensible disopiramida 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 tiene una mutación puntual de tubulina quinasa no canónica y produce raíces más cortas cuando se trata con disopiramida9,20. Las plántulas mutantes phs1-1 cultivadas en medio de agar que contenía KAND 11 tenían raíces más cortas similares a las cultivadas en disopiramide (fig. S5).
Además, observamos estructuras de microtúbulos mitóticos, como zonas de profase, husos y fragmoplastos, en el meristemo de la raíz de plántulas tratadas con KAND 11. De acuerdo con las observaciones para CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, se observó una disminución significativa en Se observó el número de microtúbulos mitóticos (Fig. 6c).
Para caracterizar la citotoxicidad de KAND 11 en resolución subcelular, tratamos células en suspensión BY-2 de tabaco con KAND 11 y observamos su respuesta. Primero agregamos KAND 11 a las células BY-2 que expresan TagRFP-TUA6, que marca los microtúbulos de forma fluorescente, para evaluar el efecto de KAND 11 en los microtúbulos corticales. La densidad de los microtúbulos corticales se evaluó mediante análisis de imágenes, que cuantificó el porcentaje de píxeles citoesqueléticos entre los píxeles citoplasmáticos. Los resultados del ensayo mostraron que después del tratamiento con KAND 11 50 μM o 100 μM durante 1 hora, la densidad disminuyó significativamente a 0,94 ± 0,74% o 0,23 ± 0,28%, respectivamente, mientras que la densidad de las células tratadas con DMSO ascendió a 1,61 ± 0,34. % (Figura 7a). Estos resultados son consistentes con la observación en Arabidopsis de que el tratamiento con KAND 11 induce la despolimerización de los microtúbulos corticales (Fig. 6b). También examinamos la línea BY-2 con filamentos de actina marcados con GFP-ABD después del tratamiento con la misma concentración de KAND 11 y observamos que el tratamiento con KAND 11 interrumpió los filamentos de actina. El tratamiento con KAND 11 50 μM o 100 μM durante 1 h redujo significativamente la densidad del filamento de actina a 1,20 ± 0,62% o 0,61 ± 0,26%, respectivamente, mientras que la densidad en las células tratadas con DMSO fue de 1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Estos resultados contrastan con los efectos de la propizamida, que no afecta los filamentos de actina, y la latrunculina B, un despolimerizador de actina que no afecta los microtúbulos (SI Figura S6). Además, el tratamiento con coumamonamida 1, ácido de cumamonamida 6 o KAND 11 no afectó los microtúbulos en las células HeLa (SI Figura S7). Por tanto, se cree que el mecanismo de acción de KAND 11 es diferente del de los disruptores del citoesqueleto conocidos. Además, nuestra observación microscópica de células BY-2 tratadas con KAND 11 reveló el inicio de la muerte celular durante el tratamiento con KAND 11 y mostró que la proporción de células muertas teñidas de azul de Evans no aumentó significativamente después de 30 minutos de tratamiento con KAND 11, mientras que después de 90 minutos de tratamiento con KAND 50 μM o 100 μM, el número de células muertas aumentó al 43,7% o al 80,1%, respectivamente (Fig. 7c). En conjunto, estos datos indican que el nuevo derivado del ácido ursólico KAND 11 es un inhibidor citoesquelético específico de las plantas con un mecanismo de acción previamente desconocido.
KAND afecta los microtúbulos corticales, los filamentos de actina y la viabilidad de las células BY-2 del tabaco. (a) Visualización de microtúbulos corticales en células BY-2 en presencia de TagRFP-TUA6. Las células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO se examinaron mediante microscopía confocal. La densidad de los microtúbulos corticales se calculó a partir de micrografías de 25 células independientes. Las letras indican diferencias significativas (prueba Tukey HSD, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. ( b ) Filamentos de actina cortical en células BY-2 visualizados en presencia de GFP-ABD2. Las células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO se examinaron mediante microscopía confocal. La densidad de los filamentos de actina cortical se calculó a partir de micrografías de 25 células independientes. Las letras indican diferencias significativas (prueba Tukey HSD, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (c) Observación de células BY-2 muertas mediante tinción con azul de Evans. Las células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO se examinaron mediante microscopía de campo brillante. norte=3. Barra de escala = 100 µm.
El descubrimiento y aplicación de nuevos productos naturales ha dado lugar a importantes avances en diversos aspectos de la vida humana, incluida la medicina y la agricultura. Se han llevado a cabo investigaciones históricas para obtener compuestos útiles a partir de recursos naturales. En particular, se sabe que los actinomicetos son útiles como antibióticos antiparasitarios para nematodos debido a su capacidad para producir diversos metabolitos secundarios como la avermectina, el compuesto principal de la ivermectina y la bleomicina y sus derivados, utilizados medicinalmente como agente anticancerígeno21,22. Asimismo, se han descubierto diversos compuestos herbicidas a partir de actinomicetos, algunos de los cuales ya se utilizan comercialmente1,23. Por lo tanto, el análisis de metabolitos de actinomicetos para aislar productos naturales con actividades biológicas deseadas se considera una estrategia eficaz. En este estudio, descubrimos un nuevo compuesto, la coumamonamida, de S. werraensis y lo sintetizamos con éxito. El ácido ursónico es un intermedio sintético de la urbenamida y sus derivados. Puede causar el rizado característico de las raíces, exhibir una actividad herbicida de moderada a fuerte y dañar directa o indirectamente los microtúbulos de las plantas. Sin embargo, el mecanismo de acción del ácido urmotonico puede diferir del de los inhibidores de microtúbulos existentes, ya que KAND 11 también altera los filamentos de actina y causa la muerte celular, lo que sugiere un mecanismo regulador por el cual el ácido urmotonico y sus derivados influyen en una amplia gama de estructuras citoesqueléticas. .
Una caracterización más detallada del ácido urbenónico ayudará a comprender mejor el mecanismo de acción del ácido urbenónico. En particular, el siguiente objetivo es evaluar la capacidad del ácido ursónico para unirse a microtúbulos reducidos para determinar si el ácido ursónico y sus derivados actúan directamente sobre los microtúbulos y los despolimerizan, o si su acción da como resultado la desestabilización de los microtúbulos. Además, en el caso de que los microtúbulos no sean un objetivo directo, identificar el sitio de acción y los objetivos moleculares del ácido ursónico en las células vegetales ayudará a comprender mejor las propiedades de los compuestos relacionados y las posibles formas de mejorar la actividad herbicida. Nuestro ensayo de bioactividad reveló la capacidad citotóxica única del ácido ursónico en el crecimiento de plantas como Arabidopsis thaliana, tabaco y hepática, mientras que ni E. coli ni las células HeLa se vieron afectadas. La poca o nula toxicidad para las células animales es una ventaja de los derivados del ácido ursónico si se desarrollan como herbicidas para su uso en campos agrícolas abiertos. De hecho, dado que los microtúbulos son estructuras comunes en los eucariotas, su inhibición selectiva en las plantas es un requisito clave para los herbicidas. Por ejemplo, la propizamida, un agente despolimerizante de microtúbulos que se une directamente a la tubulina e inhibe la polimerización, se utiliza como herbicida debido a su baja toxicidad para las células animales24. A diferencia de la disopiramida, las benzamidas relacionadas tienen diferentes especificidades objetivo. Además de los microtúbulos vegetales, el RH-4032 o la benzoxamida también inhibe los microtúbulos de células animales u oomicetos, respectivamente, y la zalilamida se utiliza como fungicida debido a su baja fitotoxicidad25,26,27. El oso recién descubierto y sus derivados exhiben citotoxicidad selectiva contra las plantas, pero vale la pena señalar que modificaciones adicionales pueden alterar su especificidad objetivo, proporcionando potencialmente derivados adicionales para el control de hongos patógenos u oomicetos.
Las propiedades únicas del ácido urbenónico y sus derivados son útiles para su desarrollo como herbicidas y su uso como herramientas de investigación. Es ampliamente reconocida la importancia del citoesqueleto en el control de la forma de las células vegetales. Estudios anteriores han demostrado que las plantas han desarrollado mecanismos complejos de organización de microtúbulos corticales mediante el control de la dinámica de los microtúbulos para controlar adecuadamente la morfogénesis. Se ha identificado un gran número de moléculas responsables de la regulación de la actividad de los microtúbulos y aún se están llevando a cabo investigaciones relacionadas3,4,28. Nuestro conocimiento actual de la dinámica de los microtúbulos en las células vegetales no explica completamente los mecanismos de organización de los microtúbulos corticales. Por ejemplo, aunque tanto la disopiramida como la orizalina pueden despolimerizar los microtúbulos, la disopiramida provoca una distorsión grave de la raíz, mientras que la orizalina tiene un efecto relativamente leve. Además, las mutaciones en la tubulina, que estabiliza los microtúbulos, también causan dextrorotación en las raíces, mientras que el paclitaxel, que también estabiliza la dinámica de los microtúbulos, no. Por lo tanto, estudiar e identificar los objetivos moleculares del ácido ursólico debería proporcionar nuevos conocimientos sobre la regulación de los microtúbulos corticales de las plantas. Del mismo modo, las comparaciones futuras de sustancias químicas que son eficaces para promover el crecimiento distorsionado, como la disopiramida, y sustancias químicas menos efectivas, como la orizalina o el ácido kumamotorico, proporcionarán pistas sobre cómo se produce el crecimiento distorsionado.
Por otro lado, los reordenamientos citoesqueléticos relacionados con las defensas son otra posibilidad para explicar la citotoxicidad del ácido ursónico. La infección de un patógeno o la introducción de un elicitor en las células vegetales provoca a veces la destrucción del citoesqueleto y la posterior muerte celular29. Por ejemplo, se ha informado que la criptoxantina derivada de oomicetos altera los microtúbulos y los filamentos de actina antes de la muerte de las células del tabaco, similar a lo que ocurre con el tratamiento KAND30,31. Las similitudes entre las respuestas de defensa y las respuestas celulares inducidas por el ácido ursónico nos llevaron a plantear la hipótesis de que desencadenan procesos celulares comunes, aunque es evidente un efecto más rápido y más fuerte del ácido ursónico que la criptoxantina. Sin embargo, los estudios han demostrado que la alteración de los filamentos de actina promueve la muerte celular espontánea, que no siempre va acompañada de una alteración de los microtúbulos29. Además, queda por ver si el patógeno o el inductor provocan un crecimiento radicular distorsionado, como lo hacen los derivados del ácido ursónico. Por tanto, el conocimiento molecular que vincula las respuestas de defensa y el citoesqueleto es un problema atractivo que debe abordarse. Al explotar la presencia de compuestos de bajo peso molecular relacionados con el ácido ursónico, así como una variedad de derivados con diferentes potencias, pueden brindar oportunidades para atacar mecanismos celulares desconocidos.
En conjunto, el descubrimiento y la aplicación de nuevos compuestos que modulan la dinámica de los microtúbulos proporcionarán métodos poderosos para abordar los complejos mecanismos moleculares que subyacen a la determinación de la forma de las células vegetales. En este contexto, el compuesto recientemente desarrollado ácido urmotonico, que afecta a los microtúbulos y filamentos de actina e induce la muerte celular, puede brindar una oportunidad para descifrar la conexión entre el control de los microtúbulos y estos otros mecanismos. Así, los análisis químicos y biológicos utilizando ácido urbenónico nos ayudarán a comprender los mecanismos reguladores moleculares que controlan el citoesqueleto de las plantas.
Inocular S. werraensis MK493-CF1 en un matraz Erlenmeyer con desconectores de 500 ml que contenga 110 ml de medio de siembra que consiste en 2% (p/v) de galactosa, 2% (p/v) de pasta de esencia, 1% (p/v) de composición de Bacto. . -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (p/v) de extracto de maíz (KOGOSTCH Co., Ltd., Japón), 0,2% (p/v) de (NH4)2SO4 y 0,2% CaCO3 en agua desionizada. (pH 7,4 antes de la esterilización). Los cultivos de semilla se incubaron en un agitador rotatorio (180 rpm) a 27°C durante 2 días. Cultivo de producción mediante fermentación en estado sólido. El cultivo de semilla (7 ml) se transfirió a un matraz K-1 de 500 ml que contenía 40 g de medio de producción que consistía en 15 g de cebada prensada (MUSO Co., Ltd., Japón) y 25 g de agua desionizada (pH no ajustado). antes de la esterilización). ). La fermentación se realizó a 30°C en oscuridad durante 14 días. El material de fermentación se extrajo con 40 ml/botella de EtOH y se centrifugó (1500 g, 4ºC, 10 min). El sobrenadante del cultivo (60 ml) se extrajo con una mezcla de MeOH al 10 %/EtOAc. La capa orgánica se evaporó a presión reducida para obtener un residuo (59,5 mg), que se sometió a HPLC con elución en gradiente (0-10 minutos: 90%) en una columna de fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × longitud 250 mm) H2O/CH3CN, 10 a 35 minutos: 90 % H2O/CH3CN al 70 % H2O/CH3CN (gradiente), 35 a 45 minutos: 90 % H2O/EtOH, 45 a 155 minutos: 90 % H2O/EtOH a 100 % EtOH (gradiente (gradiente), 155 a 200 min: 100 % EtOH) en un flujo velocidad de 1,5 ml/min, se aisló coumamonamida (1, 36,0 mg) como una sustancia blanca polvo amorfo.
Kumamotoamida(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); RMN 13C (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculado: 141,0659, valor medido: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Las semillas de Columbia (Col-0) se obtuvieron del Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis (ABRC) con permiso para uso en investigación. Las semillas de Col-0 se propagaron y mantuvieron en nuestras condiciones de laboratorio y se utilizaron como plantas de Arabidopsis de tipo salvaje. Las semillas de Arabidopsis se esterilizaron en superficie y se cultivaron en medio Murashige y Skoog de potencia media que contenía 2% de sacarosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (p/v) de ácido 2-(4-morfolino)etanosulfónico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical ). ) y agar 1,5% (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C y luz constante. T. Hashimoto (Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara) proporcionó las semillas del mutante phs1-1.
T. Hashimoto (Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara) proporcionó semillas de la cepa SR-1 y las utilizaron como plantas de tabaco de tipo silvestre. Las semillas de tabaco se esterilizaron en superficie y se remojaron en agua esterilizada durante tres noches para promover la germinación, luego se colocaron en una solución de concentración media que contenía 2 % de sacarosa, 0,05 % (p/v) de MES y 0,8 % de goma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical). Murashige. y medio Skoog) con pH 5,7 y se incubaron a 23°C bajo luz constante.
La cepa Tak-1 fue proporcionada por T. Kohchi (Universidad de Kyoto) y se utilizó como unidad experimental estándar para el estudio de la hepática. Gemma se obtuvo a partir de plantas cultivadas esterilizadas y luego se sembró en medio Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) que contenía 1 % de sacarosa y 0,3 % de goma gellan y se incubó a 23 °C bajo luz continua.
S. Hasezawa (Universidad de Tokio) proporcionó células de tabaco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2). Las células BY-2 se diluyeron 95 veces en medio Linsmeier y Skoog modificado y se suplementaron semanalmente con ácido 2,4-diclorofenoxiacético 32 . La suspensión celular se mezcló en un agitador rotatorio a 130 rpm a 27°C en la oscuridad. Lavar las células con 10 veces el volumen de medio fresco y resuspender en el mismo medio. Las líneas celulares transgénicas BY-2 que expresan de manera estable el marcador de microtúbulos TagRFP-TUA6 o el marcador de filamento de actina GFP-ABD2 bajo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor se generaron como se describe 33,34,35. Estas líneas celulares se pueden mantener y sincronizar utilizando procedimientos similares a los utilizados para la línea celular BY-2 original.
Las células HeLa se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) suplementado con suero bovino fetal al 10 %, penicilina 1,2 U/ml y estreptomicina 1,2 μg/ml en una incubadora a 37 °C con CO2 al 5 %.
Todos los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las normas y directrices japonesas de bioseguridad.
Los compuestos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) como soluciones madre y se diluyeron en medio MS para Arabidopsis y tabaco o medio Gamborg B5 para hepática. Para el ensayo de inhibición del crecimiento de raíces, se sembraron más de 10 semillas por placa en medio agar que contenía los compuestos indicados o DMSO. Las semillas se incubaron en una cámara de crecimiento durante 7 días. Se fotografiaron las plántulas y se midió la longitud de las raíces. Para el ensayo de germinación de Arabidopsis, se sembraron 48 semillas por placa en medio agar que contenía compuesto 200 μM o DMSO. Se cultivaron semillas de Arabidopsis en una cámara de crecimiento y se contó el número de plántulas germinadas 7 días después de la germinación (dag). Para el ensayo de germinación del tabaco, se sembraron 24 semillas por placa en medio agar que contenía KAND o DMSO 200 μM. Se cultivaron semillas de tabaco en una cámara de crecimiento y se contó el número de plántulas germinadas después de 14 días. Para el ensayo de inhibición del crecimiento de la hepática, se sembraron 9 embriones de cada placa en medio de agar que contenía las concentraciones indicadas de KAND o DMSO y se incubaron en una cámara de crecimiento durante 14 días.
Utilice plántulas teñidas con 5 mg/ml de yoduro de propidio (PI) para visualizar la organización del meristemo de la raíz. Las señales de PI se observaron mediante microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio de barrido láser confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
La tinción histoquímica de raíces con β-glucuronidasa (GUS) se realizó según el protocolo descrito por Malami y Benfey36. Las plántulas se fijaron en acetona al 90% durante la noche, se tiñeron con 0,5 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucurónico en tampón GUS durante 1 hora y se colocaron en una solución de cloraldehído hidratado. (8 g de hidrato de cloral, 2 ml de agua y 1 ml de glicerol) y se observaron mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial utilizando un microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Los ángulos de las raíces se midieron en plántulas de 7 días cultivadas en placas colocadas verticalmente. Mida el ángulo de la raíz desde la dirección del vector de gravedad como se describe en el paso 6.
La disposición de los microtúbulos corticales se observó como se describe, con modificaciones menores al protocolo 37. Se utilizaron anticuerpos anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) e IgG anti-ratón conjugada con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) como anticuerpos primarios y secundarios en diluciones 1:1000 y 1:100. respectivamente. Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio de barrido láser confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Adquiera imágenes de pila Z y cree proyecciones de máxima intensidad según las instrucciones del fabricante.
El ensayo de proliferación de células HeLa se realizó utilizando el Cell Counting Kit 8 (Dojindo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El crecimiento de E. coli DH5α se analizó midiendo la densidad celular en cultivo utilizando un espectrofotómetro a 600 nm (OD600).
La organización citoesquelética en células transgénicas BY-2 se observó utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con un dispositivo de escaneo confocal CSU-X1 (Yokogawa) y una cámara sCMOS (Zyla, Andor Technology). La densidad citoesquelética se evaluó mediante análisis de imágenes, que cuantificó el porcentaje de píxeles citoesqueléticos entre los píxeles citoplasmáticos en imágenes confocales utilizando el software ImageJ como se describe38,39.
Para detectar la muerte celular en células BY-2, se incubó una alícuota de la suspensión celular con azul de Evans al 0,05% durante 10 minutos a temperatura ambiente. La tinción selectiva con azul de Evans de células muertas depende de la extrusión del tinte de las células viables por la membrana plasmática intacta40. Las células teñidas se observaron utilizando un microscopio de campo brillante (BX53, Olympus).
Las células HeLa se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10 % en una incubadora humidificada a 37 °C y CO2 al 5 %. Las células se trataron con KAND 11 100 μM, ácido kumamonámico 6, kumamonamida 1, colcemid 100 ng/ml (Gibco) o Nocodmaze 100 ng/ml (Sigma) durante 6 h a 37 °C. Las células se fijaron con MetOH durante 10 min y luego con acetato durante 5 min a temperatura ambiente. Las células fijadas se incubaron con anticuerpo primario de β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluido en BSA/PBS al 0,5 % durante 2 horas, se lavaron 3 veces con TBST y luego se incubaron con anticuerpo de cabra Alexa Fluor. 488 1 hora. – IgG de ratón (Thermo Fisher Scientific: A11001) y 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluido en BSA/PBS al 0,5 %. Después de lavar con TBST tres veces, se observaron las células teñidas en un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E. Las imágenes se capturaron con una cámara CCD Hamamatsu ORCA-R2 enfriada utilizando el software MetaMorph (Molecular Devices).
Hora de publicación: 17 de junio de 2024