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El descubrimiento y el uso beneficioso de productos naturales pueden contribuir a mejorar la vida humana. Los productos químicos inhibidores del crecimiento vegetal se utilizan ampliamente como herbicidas para controlar las malezas. Debido a la necesidad de utilizar diferentes tipos de herbicidas, es necesario identificar compuestos con nuevos mecanismos de acción. En este estudio, descubrimos un nuevo compuesto N-alcoxipirrólico, la cumamonamida, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 y establecimos el proceso de síntesis completo. Mediante ensayos de actividad biológica, descubrimos que el ácido urs-monoámico es un intermediario sintético de la urs-monoamida y un potencial...inhibidor del crecimiento de las plantasAdemás, hemos desarrollado diversos derivados del ácido urbenónico, incluyendo el derivado urbeniloxi (UDA), que posee una alta actividad herbicida sin afectar negativamente el crecimiento de las células HeLa. También hemos descubierto que los derivados del ácido ursónico alteran los microtúbulos de las plantas; además, el KAND afecta los filamentos de actina e induce la muerte celular. Estos efectos multifacéticos difieren de los de los inhibidores de microtúbulos conocidos y sugieren un nuevo mecanismo de acción para el ácido ursónico, lo que representa una importante ventaja en el desarrollo de nuevos herbicidas.
El descubrimiento y la aplicación práctica de productos naturales beneficiosos y sus derivados es un medio para mejorar la calidad de vida humana. Los metabolitos secundarios producidos por microorganismos, plantas e insectos han propiciado importantes avances en la medicina y la agricultura. Muchos antibióticos y fármacos antileucémicos se han desarrollado a partir de productos naturales. Además, se han desarrollado diversos tipos de...pesticidasDe estos productos naturales se extraen fungicidas y herbicidas para su uso en la agricultura. En particular, los herbicidas para el control de malezas son herramientas importantes para aumentar el rendimiento de los cultivos en la agricultura moderna, y ya se utilizan comercialmente diversos tipos de compuestos. Diversos procesos celulares en las plantas, como la fotosíntesis, el metabolismo de aminoácidos, la síntesis de la pared celular, la regulación de la mitosis, la señalización de fitohormonas o la síntesis de proteínas, se consideran objetivos típicos de los herbicidas. Los compuestos que inhiben la función de los microtúbulos son una clase común de herbicidas que afectan el crecimiento vegetal al afectar la regulación mitótica.
Los microtúbulos son componentes del citoesqueleto y se conservan ampliamente en las células eucariotas. El heterodímero de tubulina está compuesto por α-tubulina y β-tubulina, que forman protofilamentos lineales de microtúbulos, con 13 protofilamentos que forman una estructura cilíndrica. Los microtúbulos desempeñan múltiples funciones en las células vegetales, incluyendo la determinación de la forma celular, la división celular y el transporte intracelular3,4. Las células vegetales contienen microtúbulos debajo de la membrana plasmática interfásica, y se cree que estos microtúbulos corticales controlan la organización de las microfibrillas de celulosa mediante la regulación de los complejos de celulosa sintasa4,5. Los microtúbulos corticales de las células epidérmicas radiculares, presentes en la zona de elongación rápida del ápice radicular, se ubican lateralmente, y las microfibras de celulosa siguen estos microtúbulos y limitan la dirección de la expansión celular, promoviendo así la elongación celular anisotrópica. Por lo tanto, la función de los microtúbulos está estrechamente relacionada con la morfología vegetal. Las sustituciones de aminoácidos en los genes que codifican la tubulina causan una desviación de la disposición de los microtúbulos corticales y un crecimiento hacia la izquierda o hacia la derecha en Arabidopsis 6,7. De igual manera, las mutaciones en las proteínas asociadas a los microtúbulos que regulan su dinámica también pueden provocar un crecimiento radicular distorsionado 8,9,10,11,12,13. Además, el tratamiento con herbicidas disruptores de microtúbulos, como la disopiramida, también conocida como pretilaclor, también causa un crecimiento radicular oblicuo hacia la izquierda 14. Estos datos indican que la regulación precisa de la función de los microtúbulos es crucial para determinar la dirección del crecimiento de la planta.
Se han descubierto diversos tipos de inhibidores de microtúbulos, y estos fármacos han contribuido significativamente a la investigación del citoesqueleto, así como a la agricultura y la medicina2. En particular, la orizalina, los compuestos de dinitroanilina, la disopiramida, los compuestos relacionados con la benzamida y sus análogos pueden inhibir la función de los microtúbulos y, por lo tanto, el crecimiento vegetal. Por lo tanto, se utilizan ampliamente como herbicidas. Sin embargo, dado que los microtúbulos son un componente importante de las células vegetales y animales, la mayoría de los inhibidores de microtúbulos son citotóxicos para ambos tipos celulares. Por lo tanto, a pesar de su reconocida utilidad como herbicidas, un número limitado de agentes antimicrotúbulos se utilizan con fines prácticos.
Streptomyces es un género de la familia Streptomyces, que incluye bacterias aerobias, grampositivas y filamentosas, y es ampliamente conocido por su capacidad para producir una amplia gama de metabolitos secundarios. Por lo tanto, se considera una de las fuentes más importantes de nuevos productos naturales biológicamente activos. En el presente estudio, descubrimos un nuevo compuesto llamado coumamonamida, aislado de Streptomyces werraensis MK493-CF1 y S. werraensis ISP 5486. Mediante análisis espectral y análisis espectral completo, se caracterizó la estructura de la coumamonamida y se determinó su singular esqueleto de N-alcoxipirrol. Se descubrió que el ácido ursmónico, un intermedio sintético de la ursmonoamida y sus derivados, inhibe el crecimiento y la germinación de la popular planta modelo Arabidopsis thaliana. En un estudio de la relación estructura-actividad, descubrimos que un compuesto con C9 modificado a ácido ursónico, denominado derivado noniloxi del ácido ursónico (KAND), potencia significativamente el efecto inhibidor sobre el crecimiento y la germinación. Cabe destacar que el inhibidor del crecimiento vegetal recién descubierto también afectó al crecimiento del tabaco y la hepática, y no fue citotóxico para las bacterias ni las células HeLa. Además, algunos derivados del ácido ursónico inducen un fenotipo radicular distorsionado, lo que implica que estos derivados afectan directa o indirectamente a los microtúbulos. En consonancia con esta idea, nuestras observaciones de microtúbulos marcados inmunohistoquímicamente o con proteínas fluorescentes indican que el tratamiento con KAND despolimeriza los microtúbulos. Además, el tratamiento con derivados del ácido kumamotonico alteró los microfilamentos de actina. Por lo tanto, hemos descubierto un nuevo inhibidor del crecimiento vegetal cuyo mecanismo de acción único implica la destrucción del citoesqueleto.
La cepa MK493-CF1 se aisló del suelo en Shinagawa-ku, Tokio. Formó un micelio estromal bien ramificado. Se determinó la secuencia parcial del gen del ARN ribosómico 16S (1422 pb). Esta cepa es muy similar a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: cepa típica, 99,93%). Con base en este resultado, se determinó que esta cepa estaba estrechamente relacionada con la cepa tipo de S. werraensis. Por lo tanto, la denominamos provisionalmente S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T también produce los mismos compuestos bioactivos. Dado que la investigación inicial sobre la obtención de productos naturales a partir de este microorganismo fue escasa, se realizó una investigación química adicional. Tras el cultivo de S. werraensis MK493-CF1 en medio de cebada mediante fermentación en estado sólido a 30 °C durante 14 días, el medio se extrajo con EtOH al 50 %. Se secaron 60 ml de muestra para obtener 59,5 mg de extracto crudo. El extracto crudo se sometió a HPLC de fase reversa para obtener N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida (1, denominada cumamonamida, 36,0 mg). La cantidad total de 1 representa aproximadamente el 60 % del extracto crudo. Por lo tanto, decidimos estudiar en detalle las propiedades de la kumamotoamida 1.
La cumamonamida 1 es un polvo amorfo blanco, y la espectrometría de masas de alta resolución (HRESIMS) confirma la presencia de C6H8N2O2 (Fig. 1). El fragmento de pirrol sustituido en C2 de este compuesto se caracteriza por δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH en el espectro de RMN de 1H: 4,5 Hz, H-5) y δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6). El espectro de RMN de 13C muestra la presencia de cuatro átomos de carbono sp2. La presencia de un grupo amida en la posición C2 se evaluó mediante correlación HMBC desde el protón C-3 hasta el carbono carbonílico de la amida en δC 161,1. Además, los picos de RMN de 1H y 13C en δH 4,10 (3H, S) y δC 68,3 indican la presencia de grupos N-metoxi en la molécula. Aunque la posición correcta del grupo metoxi aún no se había determinado mediante análisis espectroscópicos, como la espectroscopia de diferencia mejorada y la abreviatura nuclear de Overhauser (NOEDF), la N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida se convirtió en el primer compuesto candidato.
Para determinar la estructura correcta de 1, se realizó una síntesis total (Fig. 2a). El tratamiento de la 2-aminopiridina 2, disponible comercialmente, con m-CPBA resultó en el correspondiente N-óxido 3 con un rendimiento cuantitativo. Tras la 2-aminoazidación de 2, se llevó a cabo la reacción de ciclocondensación descrita por Abramovich en benceno a 90 °C para obtener el 1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitrilo 5 deseado en gramos. Velocidad del 60 % (dos etapas). 15,16. La metilación e hidrólisis de 4 dieron lugar al ácido 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílico (denominado "ácido cumotónico", 6) con un buen rendimiento (70 %, dos etapas). Finalmente, la amidación mediante el intermedio de cloruro de ácido 6 utilizando amoníaco acuoso dio lugar a la amida de Kumamoto 1 con un rendimiento del 98 %. Todos los datos espectrales del 1 sintetizado fueron similares a los del 1 aislado, por lo que se determinó la estructura del 1;
Síntesis general y análisis de la actividad biológica de la urbenamida y el ácido urbénico. (a) Síntesis total de la amida de Kumamoto. (b) Plántulas silvestres de Arabidopsis Columbia (Col) de siete días de edad se cultivaron en placas de Murashige y Skoog (MS) que contenían cumamonamida 6 o cumamonamida 1 en las concentraciones indicadas. Barra de escala = 1 cm.
En primer lugar, evaluamos las actividades biológicas de la urbenamida y sus intermediarios para determinar su capacidad de modular el crecimiento vegetal. Añadimos diversas concentraciones de ursmonamida 1 o ácido ursmónico 6 al medio de agar MS y cultivamos plántulas de Arabidopsis thaliana en este medio. Estos ensayos mostraron que altas concentraciones (500 μM) de 6 inhibieron el crecimiento radicular (Fig. 2b). A continuación, generamos diversos derivados sustituyendo la posición N1 de 6 y realizamos estudios de la relación estructura-actividad en ellos (el proceso de síntesis de análogos se describe en la Información Complementaria (IE)). Las plántulas de Arabidopsis se cultivaron en un medio que contenía 50 μM de derivados de ácido ursónico y se midió la longitud radicular, como se muestra en la imagen. Como se muestra en las Figuras 3a, b y S1, los cumamoácidos presentan diferentes longitudes de cadenas alcoxi lineales (9, 10, 11, 12 y 13) o cadenas alcoxi largas (15, 16 y 17) en la posición N1. Los derivados mostraron una inhibición significativa del crecimiento radicular. Además, se observó que la aplicación de 200 μM de 10, 11 o 17 inhibió la germinación (Figs. 3c y S2).
Estudio de la relación estructura-actividad de la amida de Kumamoto y compuestos relacionados. (a) Estructura y esquema de síntesis de análogos. (b) Cuantificación de la longitud de la raíz de plántulas de 7 días cultivadas en medio MS con o sin 50 μM de derivados de cumamonamida. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba t, p< 0,05). n>18. Los datos se presentan como media ± DE. nt significa «no analizado» porque más del 50 % de las semillas no germinaron. (c) Cuantificación de la tasa de germinación de semillas tratadas incubadas durante 7 días en medio MS con o sin 200 μM de cumamonamida y compuestos relacionados. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba de chi-cuadrado). n = 96.
Curiosamente, la adición de cadenas laterales de alquilo más largas que C9 redujo la actividad inhibidora, lo que sugiere que los compuestos relacionados con el ácido kumamotoico requieren cadenas laterales de un cierto tamaño para exhibir su actividad biológica.
Debido a que el análisis de la relación estructura-actividad mostró que C9 se modificó a ácido ursónico y que el derivado noniloxi del ácido ursónico (en adelante denominado KAND 11) fue el inhibidor de crecimiento vegetal más eficaz, realizamos una caracterización más detallada de KAND 11. El tratamiento de Arabidopsis con 50 μM de KAND 11 previno casi por completo la germinación, mientras que concentraciones más bajas (40, 30, 20 o 10 μM) de KAND 11 inhibieron el crecimiento de la raíz de manera dependiente de la dosis (Fig. 4a, b). Para probar si KAND 11 afecta la viabilidad del meristemo radicular, examinamos los meristemos radiculares teñidos con yoduro de propidio (PI) y medimos el tamaño del área del meristemo. El tamaño del meristemo de las plántulas cultivadas en un medio que contenía 25 μM de KAND-11 fue de 151,1 ± 32,5 μm, mientras que el tamaño del meristemo de las plántulas cultivadas en un medio de control que contenía DMSO fue de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), lo que indica que KAND-11 restaura la actividad celular. propagación. Meristemo de la raíz. En consonancia con esto, el tratamiento con KAND 11 redujo la cantidad de la señal del marcador de división celular CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS en el meristemo de la raíz (Fig. 4e) 17 . Estos resultados indican que KAND 11 inhibe el crecimiento de la raíz al reducir la actividad de proliferación celular.
Análisis del efecto inhibidor de los derivados del ácido urbenónico (derivados urbeniloxi) sobre el crecimiento. (a) Plántulas de Col silvestre de 7 días de edad cultivadas en placas MS con las concentraciones indicadas de KAND 11. Barra de escala = 1 cm. (b) Cuantificación de la longitud de la raíz. Las letras indican diferencias significativas (prueba HSD de Tukey, p< 0,05). n>16. Los datos se muestran como media ± DE. (c) Microscopía confocal de raíces de Col de tipo silvestre teñidas con yoduro de propidio, cultivadas en placas MS con o sin 25 μM de KAND 11. Los corchetes blancos indican el meristemo radicular. Barra de escala = 100 µm. (d) Cuantificación del tamaño del meristemo radicular (n = 10 a 11). Las diferencias estadísticas se determinaron mediante la prueba t (p< 0,05). Las barras representan el tamaño medio del meristemo. (e) Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) de un meristemo de raíz que contiene el constructo CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS teñido y teñido en plántulas de 5 días cultivadas en placas MS con o sin ensayo KAND de 25 µM.
La fitotoxicidad de KAND 11 se evaluó adicionalmente utilizando otra planta dicotiledónea, el tabaco (Nicotiana tabacum), y un importante organismo modelo terrestre, la hepática (Marchantia polymorpha). Al igual que en el caso de Arabidopsis, las plántulas de tabaco SR-1 cultivadas en un medio con 25 μM de KAND 11 produjeron raíces más cortas (Fig. 5a). Además, 40 de las 48 semillas germinaron en placas con 200 μM de KAND 11, mientras que las 48 semillas germinaron en medios con tratamiento simulado, lo que indica que las concentraciones más altas de KAND fueron significativas (p< 0,05; prueba de chi al cuadrado) inhibió la germinación del tabaco (Fig. 5b). Además, la concentración de KAND 11 que inhibió el crecimiento bacteriano en hepáticas fue similar a la concentración efectiva en Arabidopsis (Fig. 5c). Estos resultados indican que KAND 11 puede inhibir el crecimiento de diversas plantas. A continuación, investigamos la posible citotoxicidad de compuestos relacionados con la monoamida de oso en otros organismos, concretamente en células HeLa humanas y en la cepa DH5α de Escherichia coli, como representantes de células animales y bacterianas superiores, respectivamente. En una serie de ensayos de proliferación celular, observamos que la cumamonamida 1, el ácido cumamonamídico 6 y KAND 11 no afectaron el crecimiento de células HeLa o E. coli a concentraciones de 100 μM (Fig. 5d,e).
Inhibición del crecimiento de KAND 11 en organismos distintos de Arabidopsis. (a) Se cultivaron plántulas de tabaco SR-1 de tipo silvestre de dos semanas de edad en placas MS posicionadas verticalmente que contenían 25 μM de KAND 11. (b) Se cultivaron plántulas de tabaco SR-1 de tipo silvestre de dos semanas de edad en placas MS posicionadas horizontalmente que contenían 200 μM de KAND 11. (c) Brotes de hepática Tak-1 de tipo silvestre de dos semanas de edad cultivados en placas Gamborg B5 con las concentraciones indicadas de KAND 11. Las flechas rojas indican las esporas que dejaron de crecer dentro del período de incubación de dos semanas. (d) Ensayo de proliferación celular de células HeLa. El número de células viables se midió a intervalos de tiempo fijos utilizando un kit de recuento celular 8 (Dojindo). Como control, las células HeLa se trataron con 5 μg/ml de actinomicina D (Act D), que inhibe la transcripción de la ARN polimerasa y causa la muerte celular. Los análisis se realizaron por triplicado. (e) Ensayo de proliferación celular de E. coli. El crecimiento de E. coli se analizó midiendo la DO₂₄. Como control, las células se trataron con 50 μg/ml de ampicilina (Amp), que inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana. Los análisis se realizaron por triplicado.
Para descifrar el mecanismo de acción de la citotoxicidad causada por compuestos relacionados con la uramida, reanalizamos derivados del ácido urbénico con efectos inhibitorios moderados, como se muestra en la imagen. Como se muestra en las Figuras 2b, 6a, las plántulas cultivadas en placas de agar que contenían altas concentraciones (200 μM) de ácido urmotónico 6 produjeron raíces más cortas y curvadas hacia la izquierda (θ = – 23,7 ± 6,1), mientras que las plántulas cultivadas en el medio de control produjeron raíces casi rectas (θ = – 3,8 ± 7,1). Se sabe que este crecimiento oblicuo característico resulta de la disfunción de los microtúbulos corticales14,18. En consonancia con este hallazgo, los fármacos desestabilizadores de microtúbulos disopiramida y orizalina indujeron una inclinación radicular similar en nuestras condiciones de crecimiento (Figs. 2b, 6a). Al mismo tiempo, probamos derivados del ácido urmotónico y seleccionamos varios de ellos que, a ciertas concentraciones, indujeron un crecimiento radicular oblicuo. Los compuestos 8, 9 y 15 cambiaron la dirección del crecimiento radicular a 75 μM, 50 μM y 40 μM, respectivamente, lo que indica que estos compuestos pueden desestabilizar eficazmente los microtúbulos (Fig. 2b, 6a). También probamos el derivado del ácido ursólico más potente, KAND 11, a una concentración más baja (15 µM) y descubrimos que la aplicación de KAND 11 inhibió el crecimiento radicular y que la dirección del crecimiento radicular fue desigual, aunque tendieron a inclinarse hacia la izquierda (Figura C3). . Debido a que las concentraciones más altas de fármacos desestabilizadores de microtúbulos a veces inhiben el crecimiento de la planta en lugar de causar la inclinación de la raíz, posteriormente evaluamos la posibilidad de que KAND 11 afecte a los microtúbulos observando los microtúbulos corticales en las células epidérmicas de la raíz. La inmunohistoquímica con anticuerpos anti-β-tubulina en células epidérmicas de raíces de plántulas tratadas con 25 μM de KAND 11 mostró la desaparición de casi todos los microtúbulos corticales en las células epidérmicas de la zona de elongación (Fig. 6b). Estos resultados indican que el ácido kumamotónico y sus derivados actúan directa o indirectamente sobre los microtúbulos para destruirlos y que estos compuestos son nuevos inhibidores de microtúbulos.
El ácido ursónico y sus derivados alteran los microtúbulos corticales en Arabidopsis thaliana. (a) Ángulo de inclinación radicular medido en presencia de diversos derivados del ácido ursónico a las concentraciones indicadas. También se analizaron los efectos de dos compuestos conocidos por inhibir los microtúbulos: disopiramida y orizalina. El recuadro muestra el estándar utilizado para medir el ángulo de crecimiento radicular. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba t, p).< 0,05). n>19. Barra de escala = 1 cm. (b) Microtúbulos corticales en células epidérmicas en la zona de elongación. Los microtúbulos en raíces silvestres de Arabidopsis Col cultivadas en placas MS con o sin 25 μM de KAND 11 se visualizaron mediante tinción inmunohistoquímica utilizando anticuerpos primarios de β-tubulina y anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor. Barra de escala = 10 µm. (c) Estructura mitótica de los microtúbulos en el meristemo radicular. Los microtúbulos se visualizaron mediante tinción inmunohistoquímica. Las estructuras mitóticas, incluyendo zonas de profase, husos y fragmoplastos, se contaron a partir de imágenes confocales. Las flechas indican las estructuras mitóticas de los microtúbulos. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba t, p< 0,05). n>9. Barra de escala = 50 µm.
Aunque Ursa tiene la capacidad de alterar la función de los microtúbulos, se espera que su mecanismo de acción sea diferente al de los agentes despolimerizantes de microtúbulos típicos. Por ejemplo, concentraciones más altas de agentes despolimerizantes de microtúbulos como la disopiramida y la orizalina inducen la expansión anisotrópica de las células epidérmicas, mientras que KAND 11 no lo hace. Además, la aplicación conjunta de KAND 11 y disopiramida resultó en una respuesta combinada de crecimiento radicular inducida por disopiramida y se observó inhibición del crecimiento inducida por KAND 11 (Fig. S4). También analizamos la respuesta del mutante hipersensible disopiramida 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 presenta una mutación puntual no canónica de la tubulina quinasa y produce raíces más cortas cuando se trata con disopiramida9,20. Las plántulas del mutante phs1-1 cultivadas en medio de agar con KAND 11 presentaron raíces más cortas, similares a las cultivadas en disopiramida (fig. S5).
Además, observamos estructuras de microtúbulos mitóticos, como zonas de profase, husos y fragmoplastos, en el meristemo de la raíz de plántulas tratadas con KAND 11. En consonancia con las observaciones para CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, se observó una disminución significativa en el número de microtúbulos mitóticos (Fig. 6c).
Para caracterizar la citotoxicidad de KAND 11 en la resolución subcelular, tratamos células de suspensión de tabaco BY-2 con KAND 11 y observamos su respuesta. Primero añadimos KAND 11 a células BY-2 que expresaban TagRFP-TUA6, que marca fluorescentemente los microtúbulos, para evaluar el efecto de KAND 11 en los microtúbulos corticales. La densidad de los microtúbulos corticales se evaluó mediante análisis de imagen, que cuantificó el porcentaje de píxeles del citoesqueleto entre los píxeles citoplasmáticos. Los resultados del ensayo mostraron que después del tratamiento con 50 μM o 100 μM de KAND 11 durante 1 hora, la densidad disminuyó significativamente a 0,94 ± 0,74% o 0,23 ± 0,28%, respectivamente, mientras que la densidad de las células tratadas con DMSO ascendió a 1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Estos resultados son consistentes con la observación en Arabidopsis de que el tratamiento con KAND 11 induce la despolimerización de los microtúbulos corticales (Fig. 6b). También examinamos la línea BY-2 con filamentos de actina marcados con GFP-ABD después del tratamiento con la misma concentración de KAND 11 y observamos que el tratamiento con KAND 11 interrumpió los filamentos de actina. El tratamiento con 50 μM o 100 μM de KAND 11 durante 1 h redujo significativamente la densidad de filamentos de actina a 1,20 ± 0,62% o 0,61 ± 0,26%, respectivamente, mientras que la densidad en células tratadas con DMSO fue de 1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Estos resultados contrastan con los efectos de la propizamida, que no afecta a los filamentos de actina, y la latrunculina B, un despolimerizador de actina que no afecta a los microtúbulos (SI Figura S6). Además, el tratamiento con cumamonamida 1, ácido cumamonamida 6 o KAND 11 no afectó a los microtúbulos en células HeLa (SI Figura S7). Por lo tanto, se cree que el mecanismo de acción de KAND 11 es diferente al de los disruptores del citoesqueleto conocidos. Además, nuestra observación microscópica de células BY-2 tratadas con KAND 11 reveló el inicio de la muerte celular durante el tratamiento con KAND 11 y mostró que la proporción de células muertas teñidas con azul de Evans no aumentó significativamente después de 30 min de tratamiento con KAND 11, mientras que después de 90 minutos de tratamiento con 50 μM o 100 μM de KAND, el número de células muertas aumentó al 43,7% o al 80,1%, respectivamente (Fig. 7c). Tomados en conjunto, estos datos indican que el nuevo derivado del ácido ursólico KAND 11 es un inhibidor del citoesqueleto específico de las plantas con un mecanismo de acción previamente desconocido.
KAND afecta los microtúbulos corticales, los filamentos de actina y la viabilidad de las células BY-2 de tabaco. (a) Visualización de los microtúbulos corticales en células BY-2 en presencia de TagRFP-TUA6. Las células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO se examinaron mediante microscopía confocal. La densidad de microtúbulos corticales se calculó a partir de micrografías de 25 células independientes. Las letras indican diferencias significativas (prueba de Tukey HSD, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (b) Filamentos de actina cortical en células BY-2 visualizados en presencia de GFP-ABD2. Las células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 µM o 100 µM) o DMSO se examinaron mediante microscopía confocal. La densidad de los filamentos de actina cortical se calculó a partir de micrografías de 25 células independientes. Las letras indican diferencias significativas (prueba de Tukey HSD, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (c) Observación de células BY-2 muertas mediante tinción con azul de Evans. Las células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 µM o 100 µM) o DMSO se examinaron mediante microscopía de campo claro. n = 3. Barra de escala = 100 µm.
El descubrimiento y la aplicación de nuevos productos naturales ha impulsado avances significativos en diversos aspectos de la vida humana, como la medicina y la agricultura. Históricamente, se han llevado a cabo investigaciones para obtener compuestos útiles a partir de recursos naturales. En particular, se sabe que los actinomicetos son útiles como antibióticos antiparasitarios para nematodos debido a su capacidad para producir diversos metabolitos secundarios, como la avermectina, el compuesto principal de la ivermectina, la bleomicina y sus derivados, que se utiliza medicinalmente como agente anticancerígeno21,22. Asimismo, se han descubierto diversos compuestos herbicidas a partir de actinomicetos, algunos de los cuales ya se utilizan comercialmente1,23. Por lo tanto, el análisis de metabolitos de actinomicetos para aislar productos naturales con las actividades biológicas deseadas se considera una estrategia eficaz. En este estudio, descubrimos un nuevo compuesto, la cumamonamida, a partir de S. werraensis y lo sintetizamos con éxito. El ácido ursónico es un intermedio sintético de la urbenamida y sus derivados. Puede causar un enrollamiento característico de las raíces, presentar una actividad herbicida de moderada a fuerte y dañar directa o indirectamente los microtúbulos de las plantas. Sin embargo, el mecanismo de acción del ácido urmotónico puede diferir del de los inhibidores de microtúbulos existentes, ya que KAND 11 también altera los filamentos de actina y causa la muerte celular, lo que sugiere un mecanismo regulador mediante el cual el ácido urmotónico y sus derivados influyen en una amplia gama de estructuras del citoesqueleto.
Una caracterización más detallada del ácido ursónico ayudará a comprender mejor su mecanismo de acción. En particular, el siguiente objetivo es evaluar la capacidad del ácido ursónico para unirse a los microtúbulos reducidos y determinar si el ácido ursónico y sus derivados actúan directamente sobre ellos y los despolimerizan, o si su acción provoca su desestabilización. Además, cuando los microtúbulos no son un objetivo directo, identificar el sitio de acción y las dianas moleculares del ácido ursónico en las células vegetales ayudará a comprender mejor las propiedades de los compuestos relacionados y las posibles maneras de mejorar la actividad herbicida. Nuestro ensayo de bioactividad reveló la singular capacidad citotóxica del ácido ursónico en el crecimiento de plantas como Arabidopsis thaliana, tabaco y hepáticas, sin afectar a las células de E. coli ni a las células HeLa. La escasa o nula toxicidad para las células animales es una ventaja de los derivados del ácido ursónico si se desarrollan como herbicidas para su uso en campos agrícolas abiertos. De hecho, dado que los microtúbulos son estructuras comunes en eucariotas, su inhibición selectiva en plantas es un requisito clave para los herbicidas. Por ejemplo, la propizamida, un agente despolimerizante de microtúbulos que se une directamente a la tubulina e inhibe la polimerización, se utiliza como herbicida debido a su baja toxicidad para las células animales24. A diferencia de la disopiramida, las benzamidas relacionadas tienen diferentes especificidades de diana. Además de los microtúbulos de las plantas, RH-4032 o la benzoxamida también inhiben los microtúbulos de las células animales u oomicetos, respectivamente, y la zalilamida se utiliza como fungicida debido a su baja fitotoxicidad25,26,27. El oso recién descubierto y sus derivados exhiben citotoxicidad selectiva contra las plantas, pero vale la pena señalar que modificaciones adicionales pueden alterar su especificidad de diana, proporcionando potencialmente derivados adicionales para el control de hongos patógenos u oomicetos.
Las propiedades únicas del ácido urbenónico y sus derivados son útiles para su desarrollo como herbicidas y su uso como herramientas de investigación. La importancia del citoesqueleto en el control de la forma celular de las plantas es ampliamente reconocida. Estudios anteriores han demostrado que las plantas han desarrollado mecanismos complejos de organización de los microtúbulos corticales mediante el control de la dinámica de los microtúbulos para controlar adecuadamente la morfogénesis. Se ha identificado un gran número de moléculas responsables de la regulación de la actividad de los microtúbulos, y la investigación relacionada aún está en curso3,4,28. Nuestro conocimiento actual de la dinámica de los microtúbulos en las células vegetales no explica por completo los mecanismos de la organización de los microtúbulos corticales. Por ejemplo, aunque tanto la disopiramida como la orizalina pueden despolimerizar los microtúbulos, la disopiramida causa una distorsión radicular grave, mientras que la orizalina tiene un efecto relativamente leve. Además, las mutaciones en la tubulina, que estabiliza los microtúbulos, también causan dextrorrotación en las raíces, mientras que el paclitaxel, que también estabiliza la dinámica de los microtúbulos, no lo hace. Por lo tanto, el estudio y la identificación de las dianas moleculares del ácido ursólico deberían proporcionar nuevos conocimientos sobre la regulación de los microtúbulos corticales de las plantas. Asimismo, futuras comparaciones entre sustancias químicas eficaces para promover el crecimiento distorsionado, como la disopiramida, y sustancias químicas menos eficaces, como la orizalina o el ácido kumamotor, proporcionarán pistas sobre cómo se produce dicho crecimiento.
Por otro lado, los reordenamientos del citoesqueleto relacionados con la defensa son otra posibilidad para explicar la citotoxicidad del ácido ursónico. La infección de un patógeno o la introducción de un elicitor en las células vegetales a veces causa la destrucción del citoesqueleto y la posterior muerte celular29. Por ejemplo, se ha informado que la criptoxantina derivada de oomicetos altera los microtúbulos y los filamentos de actina antes de la muerte celular del tabaco, de forma similar a lo que ocurre con el tratamiento con KAND30,31. Las similitudes entre las respuestas de defensa y las respuestas celulares inducidas por el ácido ursónico nos llevaron a plantear la hipótesis de que desencadenan procesos celulares comunes, aunque es evidente un efecto más rápido y potente del ácido ursónico que de la criptoxantina. Sin embargo, estudios han demostrado que la alteración de los filamentos de actina promueve la muerte celular espontánea, que no siempre se acompaña de la alteración de los microtúbulos29. Además, queda por ver si el patógeno o el elicitor causan un crecimiento radicular distorsionado, como lo hacen los derivados del ácido ursónico. Por lo tanto, el conocimiento molecular que vincula las respuestas de defensa con el citoesqueleto es un problema interesante que debe abordarse. Al aprovechar la presencia de compuestos de bajo peso molecular relacionados con el ácido ursónico, así como una gama de derivados con diferentes potencias, podrían brindar oportunidades para abordar mecanismos celulares desconocidos.
En conjunto, el descubrimiento y la aplicación de nuevos compuestos que modulan la dinámica de los microtúbulos proporcionarán métodos eficaces para abordar los complejos mecanismos moleculares que subyacen a la determinación de la forma celular de las plantas. En este contexto, el ácido urmotónico, un compuesto recientemente desarrollado que afecta a los microtúbulos y filamentos de actina e induce la muerte celular, podría brindar la oportunidad de descifrar la conexión entre el control de los microtúbulos y estos otros mecanismos. Por lo tanto, el análisis químico y biológico con ácido urbenónico nos ayudará a comprender los mecanismos moleculares reguladores que controlan el citoesqueleto vegetal.
Se inoculó S. werraensis MK493-CF1 en un matraz Erlenmeyer con deflector de 500 mL que contenía 110 mL de medio de siembra compuesto por 2 % (p/v) de galactosa, 2 % (p/v) de pasta de esencia, 1 % (p/v) de Bacto-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (p/v) de extracto de maíz (KOGOSTCH Co., Ltd., Japón), 0,2 % (p/v) de (NH₄)₂SO₄ y 0,2 % de CaCO₃ en agua desionizada (pH 7,4 antes de la esterilización). Los cultivos de siembra se incubaron en un agitador rotatorio (180 rpm) a 27 °C durante 2 días. El cultivo de producción se realizó mediante fermentación en estado sólido. El cultivo de siembra (7 ml) se transfirió a un matraz K-1 de 500 ml que contenía 40 g de medio de producción compuesto por 15 g de cebada prensada (MUSO Co., Ltd., Japón) y 25 g de agua desionizada (pH no ajustado antes de la esterilización). La fermentación se realizó a 30 °C en oscuridad durante 14 días. El material de fermentación se extrajo con 40 ml/botella de EtOH y se centrifugó (1500 g, 4 °C, 10 min). El sobrenadante del cultivo (60 ml) se extrajo con una mezcla de MeOH/EtOAc al 10 %. La capa orgánica se evaporó a presión reducida para obtener un residuo (59,5 mg), que se sometió a HPLC con elución en gradiente (0-10 minutos: 90%) en una columna de fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, DI 10 mm × longitud 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minutos: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35-45 minutos: 90% H2O/EtOH, 45-155 minutos: 90% H2O/EtOH a 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155-200 min: 100% EtOH) a un caudal de 1,5 ml/min, se aisló cumamonamida (1, 36,0 mg) como un polvo amorfo blanco.
Kumamotoamida(1); RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculado: 141,0659, valor medido: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Las semillas de Columbia (Col-0) se obtuvieron del Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis (ABRC) con permiso para su uso en investigación. Las semillas de Col-0 se propagaron y mantuvieron en nuestras condiciones de laboratorio y se utilizaron como plantas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las semillas de Arabidopsis se esterilizaron superficialmente y se cultivaron en medio Murashige y Skoog a la mitad de su concentración que contenía 2% de sacarosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (p/v) de ácido 2-(4-morfolino)etanosulfónico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) y 1,5% de agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C y luz constante. Las semillas del mutante phs1-1 fueron proporcionadas por T. Hashimoto (Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara).
Las semillas de la cepa SR-1 fueron proporcionadas por T. Hashimoto (Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara) y se utilizaron como plantas de tabaco silvestre. Se esterilizaron superficialmente y se remojaron en agua estéril durante tres noches para promover la germinación. Posteriormente, se colocaron en una solución a la mitad de su concentración que contenía 2 % de sacarosa, 0,05 % (p/v) de MES y 0,8 % de goma gellan (medio Fujifilm Wako Pure Chemical Murashige y Skoog) con un pH de 5,7, y se incubaron a 23 °C con luz constante.
La cepa Tak-1 fue proporcionada por T. Kohchi (Universidad de Kioto) y se utilizó como unidad experimental estándar para el estudio de la hepática. La gema se obtuvo de plantas cultivadas esterilizadas y se sembró en medio Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) con 1 % de sacarosa y 0,3 % de goma gellan, incubándose a 23 °C con luz continua.
Las células BY-2 de tabaco (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) fueron proporcionadas por S. Hasezawa (Universidad de Tokio). Las células BY-2 se diluyeron 95 veces en medio modificado de Linsmeier y Skoog y se suplementaron semanalmente con ácido 2,4-diclorofenoxiacético 32 . La suspensión celular se mezcló en un agitador rotatorio a 130 rpm a 27 °C en la oscuridad. Lavar las células con 10 veces el volumen de medio fresco y resuspender en el mismo medio. Las líneas celulares transgénicas BY-2 que expresan de forma estable el marcador de microtúbulos TagRFP-TUA6 o el marcador de filamentos de actina GFP-ABD2 bajo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor se generaron como se describe33,34,35. Estas líneas celulares se pueden mantener y sincronizar utilizando procedimientos similares a los utilizados para la línea celular BY-2 original.
Las células HeLa se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 1,2 U/ml de penicilina y 1,2 μg/ml de estreptomicina en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2.
Todos los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las normas y directrices de bioseguridad japonesas.
Los compuestos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) como soluciones madre y se diluyeron en medio MS para Arabidopsis y tabaco o medio Gamborg B5 para hepáticas. Para el ensayo de inhibición del crecimiento radicular, se sembraron más de 10 semillas por placa en medio de agar que contenía los compuestos indicados o DMSO. Las semillas se incubaron en una cámara de crecimiento durante 7 días. Se fotografiaron las plántulas y se midió la longitud de las raíces. Para el ensayo de germinación de Arabidopsis, se sembraron 48 semillas por placa en medio de agar que contenía 200 μM de compuesto o DMSO. Las semillas de Arabidopsis se cultivaron en una cámara de crecimiento y se contó el número de plántulas germinadas 7 días después de la germinación (dag). Para el ensayo de germinación de tabaco, se sembraron 24 semillas por placa en medio de agar que contenía 200 μM de KAND o DMSO. Las semillas de tabaco se cultivaron en una cámara de crecimiento y se contó el número de plántulas germinadas después de 14 días. Para el ensayo de inhibición del crecimiento de la hepática, 9 embriones de cada placa se sembraron en medio de agar que contenía las concentraciones indicadas de KAND o DMSO y se incubaron en una cámara de crecimiento durante 14 días.
Se utilizaron plántulas teñidas con 5 mg/ml de yoduro de propidio (PI) para visualizar la organización del meristemo radicular. Las señales de PI se observaron mediante microscopía de fluorescencia con un microscopio confocal de barrido láser TCS SPE (Leica Microsystems).
La tinción histoquímica de raíces con β-glucuronidasa (GUS) se realizó según el protocolo descrito por Malami y Benfey36. Las plántulas se fijaron en acetona al 90 % durante la noche, se tiñeron con 0,5 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucurónico en tampón GUS durante 1 hora y se colocaron en una solución de cloraldehído hidratado (8 g de hidrato de cloral, 2 ml de agua y 1 ml de glicerol) y se observaron mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial con un microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Se midieron los ángulos radiculares en plántulas de 7 días cultivadas en placas verticales. Mida el ángulo radicular desde la dirección del vector de gravedad, como se describe en el paso 6.
La disposición de los microtúbulos corticales se observó como se describe, con modificaciones menores al protocolo 37. Se utilizaron el anticuerpo anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) y el anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) como anticuerpos primarios y secundarios a diluciones de 1:1000 y 1:100, respectivamente. Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio confocal de barrido láser TCS SPE (Leica Microsystems). Adquiera imágenes de Z-stack y cree proyecciones de máxima intensidad según las instrucciones del fabricante.
El ensayo de proliferación de células HeLa se realizó utilizando el kit de conteo celular 8 (Dojindo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El crecimiento de E. coli DH5α se analizó midiendo la densidad celular en cultivo utilizando un espectrofotómetro a 600 nm (DO600).
La organización del citoesqueleto en células BY-2 transgénicas se observó mediante un microscopio de fluorescencia equipado con un dispositivo de escaneo confocal CSU-X1 (Yokogawa) y una cámara sCMOS (Zyla, Andor Technology). La densidad del citoesqueleto se evaluó mediante análisis de imagen, que cuantificó el porcentaje de píxeles del citoesqueleto entre los píxeles citoplasmáticos en imágenes confocales utilizando el software ImageJ, como se describe38,39.
Para detectar la muerte celular en células BY-2, se incubó una alícuota de la suspensión celular con azul de Evans al 0,05 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. La tinción selectiva con azul de Evans de las células muertas depende de la extrusión del colorante de las células viables por la membrana plasmática intacta40. Las células teñidas se observaron con un microscopio de campo claro (BX53, Olympus).
Las células HeLa se cultivaron en DMEM suplementado con 10 % de FBS en una incubadora humidificada a 37 °C y 5 % de CO₂. Las células se trataron con 100 μM de KAND 11, ácido kumamonámico 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml de colcemid (Gibco) o 100 ng/ml de Nocodmaze (Sigma) durante 6 h a 37 °C. Las células se fijaron con MetOH durante 10 min y, posteriormente, con acetato durante 5 min a temperatura ambiente. Las células fijadas se incubaron con el anticuerpo primario anti-β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluido en 0,5 % de BSA/PBS durante 2 h, se lavaron 3 veces con TBST y, posteriormente, se incubaron con el anticuerpo de cabra Alexa Fluor. 488 1 hora. – IgG de ratón (Thermo Fisher Scientific: A11001) y 15 ng/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluido en BSA/PBS al 0,5 %. Tras tres lavados con TBST, se observaron las células teñidas en un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E. Las imágenes se capturaron con una cámara CCD Hamamatsu ORCA-R2 refrigerada mediante el software MetaMorph (Molecular Devices).
Hora de publicación: 17 de junio de 2024