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El descubrimiento y el uso beneficioso de productos naturales pueden contribuir a mejorar la vida humana. Los inhibidores del crecimiento vegetal se utilizan ampliamente como herbicidas para el control de malezas. Debido a la necesidad de utilizar diferentes tipos de herbicidas, surge la necesidad de identificar compuestos con nuevos mecanismos de acción. En este estudio, descubrimos un nuevo compuesto de N-alcoxipirrol, la cumamonamida, de Streptomyces werraensis MK493-CF1 y establecimos el proceso de síntesis completo. Mediante ensayos de actividad biológica, descubrimos que el ácido urs-monoámico es un intermediario sintético de la urs-monoamida y un potencial agente terapéutico.inhibidor del crecimiento vegetalAdemás, hemos desarrollado varios derivados del ácido urbenónico, incluido el derivado urbeniloxi (UDA), que presenta una alta actividad herbicida sin afectar negativamente el crecimiento de las células HeLa. También hemos descubierto que los derivados del ácido urmotónico alteran los microtúbulos vegetales; asimismo, el KAND afecta los filamentos de actina e induce la muerte celular. Estos efectos multifacéticos difieren de los de los inhibidores de microtúbulos conocidos y sugieren un nuevo mecanismo de acción para el ácido ursónico, lo que representa una ventaja importante en el desarrollo de nuevos herbicidas.
El descubrimiento y la aplicación práctica de productos naturales beneficiosos y sus derivados es un medio para mejorar la calidad de vida humana. Los metabolitos secundarios producidos por microorganismos, plantas e insectos han dado lugar a importantes avances en medicina y agricultura. Muchos antibióticos y fármacos antileucémicos se han desarrollado a partir de productos naturales. Además, diversos tipos depesticidasDe estos productos naturales se extraen fungicidas y herbicidas para su uso en la agricultura. En particular, los herbicidas para el control de malezas son herramientas importantes para aumentar el rendimiento de los cultivos en la agricultura moderna, y diversos tipos de compuestos ya se utilizan comercialmente. Varios procesos celulares en las plantas, como la fotosíntesis, el metabolismo de los aminoácidos, la síntesis de la pared celular, la regulación de la mitosis, la señalización de fitohormonas o la síntesis de proteínas, se consideran objetivos típicos de los herbicidas. Los compuestos que inhiben la función de los microtúbulos son una clase común de herbicidas que afectan el crecimiento de las plantas al afectar la regulación mitótica².
Los microtúbulos son componentes del citoesqueleto y se conservan ampliamente en las células eucariotas. El heterodímero de tubulina consta de α-tubulina y β-tubulina, que forman protofilamentos de microtúbulos lineales, con 13 protofilamentos que forman una estructura cilíndrica. Los microtúbulos desempeñan múltiples funciones en las células vegetales, incluyendo la determinación de la forma celular, la división celular y el transporte intracelular3,4. Las células vegetales contienen microtúbulos debajo de la membrana plasmática en interfase, y se cree que estos denominados microtúbulos corticales controlan la organización de las microfibrillas de celulosa mediante la regulación de los complejos de la celulosa sintasa4,5. Los microtúbulos corticales de las células epidérmicas de la raíz, presentes en la zona de elongación rápida del ápice radicular, se localizan lateralmente, y las microfibras de celulosa siguen estos microtúbulos y limitan la dirección de la expansión celular, promoviendo así la elongación celular anisotrópica. Por lo tanto, la función de los microtúbulos está estrechamente relacionada con la morfología vegetal. Las sustituciones de aminoácidos en los genes que codifican la tubulina provocan una asimetría en la disposición de los microtúbulos corticales y un crecimiento hacia la izquierda o la derecha en Arabidopsis 6,7. De manera similar, las mutaciones en las proteínas asociadas a los microtúbulos que regulan su dinámica también pueden provocar un crecimiento radicular distorsionado8,9,10,11,12,13. Además, el tratamiento con herbicidas que alteran los microtúbulos, como la disopiramida (también conocida como pretilaclor), también causa un crecimiento radicular oblicuo hacia la izquierda14. Estos datos indican que la regulación precisa de la función de los microtúbulos es fundamental para determinar la dirección del crecimiento de la planta.
Se han descubierto diversos tipos de inhibidores de microtúbulos, y estos fármacos han contribuido significativamente a la investigación del citoesqueleto, así como a la agricultura y la medicina². En particular, la orizalina, los compuestos de dinitroanilina, la disopiramida, los compuestos relacionados con la benzamida y sus análogos pueden inhibir la función de los microtúbulos y, por lo tanto, el crecimiento de las plantas. Por consiguiente, se utilizan ampliamente como herbicidas. Sin embargo, dado que los microtúbulos son un componente importante de las células vegetales y animales, la mayoría de los inhibidores de microtúbulos son citotóxicos para ambos tipos de células. Por lo tanto, a pesar de su reconocida utilidad como herbicidas, un número limitado de agentes antimicrotúbulos se utiliza con fines prácticos.
Streptomyces es un género de la familia Streptomyces, que incluye bacterias filamentosas, grampositivas y aerobias, y es ampliamente conocido por su capacidad para producir una amplia gama de metabolitos secundarios. Por lo tanto, se considera una de las fuentes más importantes de nuevos productos naturales biológicamente activos. En el presente estudio, descubrimos un nuevo compuesto llamado cumamonamida, que fue aislado de Streptomyces werraensis MK493-CF1 y S. werraensis ISP 5486. Usando análisis espectral y análisis espectral completo, se caracterizó la estructura de cumamonamida y se determinó su esqueleto N-alcoxipirrol único. síntesis. Se encontró que el ácido ursmónico, un intermedio sintético de ursmonoamida y sus derivados, inhibe el crecimiento y la germinación de la popular planta modelo Arabidopsis thaliana. En un estudio de relación estructura-actividad, encontramos que un compuesto con C9 modificado a ácido ursónico, llamado derivado noniloxi del ácido ursónico (KAND), mejora significativamente el efecto inhibidor sobre el crecimiento y la germinación. Cabe destacar que el inhibidor del crecimiento vegetal recientemente descubierto también afectó el crecimiento del tabaco y la hepática, y no fue citotóxico para las bacterias ni para las células HeLa. Además, algunos derivados del ácido urmotónico inducen un fenotipo radicular distorsionado, lo que implica que estos derivados afectan directa o indirectamente a los microtúbulos. En consonancia con esta idea, nuestras observaciones de microtúbulos marcados mediante inmunohistoquímica o con proteínas fluorescentes indican que el tratamiento con KAND despolimeriza los microtúbulos. Asimismo, el tratamiento con derivados del ácido kumamotónico alteró los microfilamentos de actina. Por lo tanto, hemos descubierto un nuevo inhibidor del crecimiento vegetal cuyo mecanismo de acción único implica la destrucción del citoesqueleto.
La cepa MK493-CF1 fue aislada del suelo en Shinagawa-ku, Tokio. Esta cepa formó un micelio estromal bien ramificado. Se determinó la secuencia parcial del gen del ARN ribosomal 16S (1422 pb). Esta cepa es muy similar a S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 pb, T: cepa típica, 99,93%). Con base en este resultado, se determinó que esta cepa estaba estrechamente relacionada con la cepa tipo de S. werraensis. Por lo tanto, provisionalmente la denominamos S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T también produce los mismos compuestos bioactivos. Dado que existía poca investigación previa sobre la obtención de productos naturales a partir de este microorganismo, se llevó a cabo una investigación química adicional. Tras el cultivo de S. werraensis MK493-CF1 en medio de cebada mediante fermentación en estado sólido a 30 °C durante 14 días, el medio se extrajo con etanol al 50 %. Se secaron 60 ml de muestra para obtener 59,5 mg de extracto crudo. Este extracto crudo se sometió a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en fase inversa para obtener N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida (1, denominada cumamotoamida, 36,0 mg). La cantidad total de 1 representa aproximadamente el 60 % del extracto crudo. Por lo tanto, decidimos estudiar en detalle las propiedades de la cumamotoamida 1.
La cumamonamida 1 es un polvo amorfo blanco y la espectrometría de masas de alta resolución (HRESIMS) confirma C6H8N2O2 (Fig. 1). El fragmento de pirrol sustituido en C2 de este compuesto se caracteriza por δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH en el espectro de RMN de 1H: 4.5 Hz, H-5) y δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), y el espectro de RMN de 13C muestra la presencia de cuatro átomos de carbono sp2. La presencia de un grupo amida en la posición C2 se evaluó mediante la correlación HMBC del protón C-3 al carbono carbonilo de la amida en δC 161.1. Además, los picos de RMN de 1H y 13C en δH 4.10 (3H, S) y δC 68.3 indican la presencia de grupos N-metoxi en la molécula. Si bien la posición correcta del grupo metoxi aún no se había determinado mediante análisis espectroscópicos como la espectroscopia diferencial mejorada y la abreviatura nuclear de Overhauser (NOEDF), la N-metoxi-1H-pirrol-2-carboxamida se convirtió en el primer compuesto candidato.
Para determinar la estructura correcta de 1, se realizó una síntesis total (Fig. 2a). El tratamiento de la 2-aminopiridina 2 disponible comercialmente con m-CPBA dio como resultado el N-óxido 3 correspondiente con un rendimiento cuantitativo. Después de la 2-aminoazidación de 2, la reacción de ciclocondensación descrita por Abramovich se llevó a cabo en benceno a 90 °C para obtener el 1-hidroxi-1H-pirrol-2-carbonitrilo 5 deseado en gramos. Velocidad 60% (dos etapas). 15,16. La metilación e hidrólisis de 4 luego dieron ácido 1-metoxi-1H-pirrol-2-carboxílico (denominado “ácido cumotónico”, 6) con buen rendimiento (70%, dos pasos). Finalmente, la amidación a través del intermedio de cloruro de ácido 6 usando amoníaco acuoso dio amida de Kumamoto 1 con un rendimiento del 98%. Todos los datos espectrales de 1 sintetizado fueron similares a 1 aislado, por lo que se determinó la estructura de 1;
Síntesis general y análisis de la actividad biológica de la urbenamida y el ácido urbénico. (a) Síntesis total de la amida de Kumamoto. (b) Plántulas de Arabidopsis Columbia (Col) de tipo silvestre de siete días de edad se cultivaron en placas de Murashige y Skoog (MS) que contenían cumamonamida 6 o cumamonamida 1 en las concentraciones indicadas. Barra de escala = 1 cm.
Primero, evaluamos las actividades biológicas de la urbenamida y sus intermediarios por su capacidad para modular el crecimiento de las plantas. Agregamos varias concentraciones de ursmonamida 1 o ácido ursmónico 6 al medio de agar MS y cultivamos plántulas de Arabidopsis thaliana en este medio. Estos ensayos mostraron que altas concentraciones (500 μM) de 6 inhibieron el crecimiento de la raíz (Fig. 2b). Luego, generamos varios derivados sustituyendo la posición N1 de 6 y realizamos estudios de relación estructura-actividad en ellos (el proceso de síntesis de análogos se describe en la Información de apoyo (SI)). Las plántulas de Arabidopsis se cultivaron en un medio que contenía 50 μM de derivados del ácido ursónico, y se midió la longitud de la raíz, como se muestra en la imagen. Como se muestra en las figuras 3a, b y S1, los ácidos cumamo presentan cadenas alcoxi lineales de diferente longitud (9, 10, 11, 12 y 13) o cadenas alcoxi largas (15, 16 y 17) en la posición N1. Los derivados mostraron una inhibición significativa del crecimiento de la raíz. Además, observamos que la aplicación de 200 μM de 10, 11 o 17 inhibió la germinación (Figs. 3c y S2).
Estudio de la relación estructura-actividad de la amida de Kumamoto y compuestos relacionados. (a) Estructura y esquema de síntesis de análogos. (b) Cuantificación de la longitud de la raíz de plántulas de 7 días cultivadas en medio MS con o sin derivados de cumamonamida de 50 μM. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba t, p< 0,05). n>18. Los datos se muestran como media ± DE. nt significa “no probado” porque más del 50 % de las semillas no germinaron. (c) Cuantificación de la tasa de germinación de semillas tratadas incubadas durante 7 días en medio MS con o sin 200 μM de cumamonamida y compuestos relacionados. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba de chi-cuadrado). n=96.
Curiosamente, la adición de cadenas laterales de alquilo más largas que C9 redujo la actividad inhibidora, lo que sugiere que los compuestos relacionados con el ácido kumamotoico requieren cadenas laterales de cierto tamaño para exhibir su actividad biológica.
Debido a que el análisis de la relación estructura-actividad mostró que C9 se modificó a ácido ursónico y que el derivado noniloxi del ácido ursónico (en adelante denominado KAND 11) fue el inhibidor de crecimiento vegetal más efectivo, realizamos una caracterización más detallada de KAND 11. El tratamiento de Arabidopsis con 50 μM de KAND 11 previno casi por completo la germinación, mientras que concentraciones más bajas (40, 30, 20 o 10 μM) de KAND 11 inhibieron el crecimiento de la raíz de manera dosis-dependiente (Fig. 4a, b). Para probar si KAND 11 afecta la viabilidad del meristemo de la raíz, examinamos meristemos de la raíz teñidos con yoduro de propidio (PI) y medimos el tamaño del área del meristemo. El tamaño del meristemo de las plántulas cultivadas en un medio que contenía 25 μM de KAND-11 fue de 151,1 ± 32,5 μm, mientras que el tamaño del meristemo de las plántulas cultivadas en un medio de control que contenía DMSO fue de 264,7 ± 30,8 μm (Fig. 4c, d), lo que indica que KAND-11 restaura la actividad celular. propagación. Meristemo de la raíz. En consonancia con esto, el tratamiento con KAND 11 redujo la cantidad de señal del marcador de división celular CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS en el meristemo de la raíz (Fig. 4e) 17 . Estos resultados indican que KAND 11 inhibe el crecimiento de la raíz al reducir la actividad de proliferación celular.
Análisis del efecto inhibidor de los derivados del ácido urbenónico (derivados de urbeniloxi) sobre el crecimiento. (a) Plántulas de tipo silvestre Col de 7 días de edad cultivadas en placas MS con las concentraciones indicadas de KAND 11. Barra de escala = 1 cm. (b) Cuantificación de la longitud de la raíz. Las letras indican diferencias significativas (prueba HSD de Tukey, p< 0,05). n>16. Los datos se muestran como media ± DE. (c) Microscopía confocal de raíces Col de tipo silvestre teñidas con yoduro de propidio cultivadas en placas MS con o sin 25 μM de KAND 11. Los corchetes blancos indican el meristemo radicular. Barra de escala = 100 µm. (d) Cuantificación del tamaño del meristemo radicular (n = 10 a 11). Las diferencias estadísticas se determinaron mediante la prueba t (p< 0,05). Las barras representan el tamaño promedio del meristemo. (e) Microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) de un meristemo de raíz que contiene el constructo CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS teñido y teñido en plántulas de 5 días de edad cultivadas en placas MS con o sin ensayo KAND de 25 µM.
La fitotoxicidad de KAND 11 se probó además utilizando otra planta dicotiledónea, el tabaco (Nicotiana tabacum), y un importante organismo modelo de plantas terrestres, la hepática (Marchantia polymorpha). Al igual que en el caso de Arabidopsis, las plántulas de tabaco SR-1 cultivadas en un medio que contenía 25 μM de KAND 11 produjeron raíces más cortas (Fig. 5a). Además, 40 de 48 semillas germinaron en placas que contenían 200 μM de KAND 11, mientras que las 48 semillas germinaron en medios tratados con placebo, lo que indica que concentraciones más altas de KAND fueron significativas (p< 0,05; prueba chi cuadrado) inhibió la germinación del tabaco. (Fig. 5b). Además, la concentración de KAND 11 que inhibió el crecimiento bacteriano en la hepática fue similar a la concentración efectiva en Arabidopsis (Fig. 5c). Estos resultados indican que KAND 11 puede inhibir el crecimiento de una variedad de plantas. Luego investigamos la posible citotoxicidad de compuestos relacionados con monoamida de oso en otros organismos, a saber, células HeLa humanas y la cepa DH5α de Escherichia coli, como representantes de células animales superiores y bacterianas, respectivamente. En una serie de ensayos de proliferación celular, observamos que la cumamonamida 1, el ácido cumamonamídico 6 y KAND 11 no afectaron el crecimiento de las células HeLa o E. coli a concentraciones de 100 μM (Fig. 5d,e).
Inhibición del crecimiento de KAND 11 en organismos no Arabidopsis. (a) Plántulas de tabaco SR-1 de tipo silvestre de dos semanas de edad se cultivaron en placas MS colocadas verticalmente que contenían 25 μM de KAND 11. (b) Plántulas de tabaco SR-1 de tipo silvestre de dos semanas de edad se cultivaron en placas MS colocadas horizontalmente que contenían 200 μM de KAND 11. (c) Brotes de hepática Tak-1 de tipo silvestre de dos semanas de edad cultivados en placas Gamborg B5 con las concentraciones indicadas de KAND 11. Las flechas rojas indican esporas que dejaron de crecer dentro del período de incubación de dos semanas. (d) Ensayo de proliferación celular de células HeLa. El número de células viables se midió a intervalos de tiempo fijos utilizando un kit de recuento celular 8 (Dojindo). Como control, las células HeLa se trataron con 5 μg/ml de actinomicina D (Act D), que inhibe la transcripción de la ARN polimerasa y causa la muerte celular. Los análisis se realizaron por triplicado. e) Ensayo de proliferación celular de E. coli. El crecimiento de E. coli se analizó midiendo la absorbancia a 600 nm (OD600). Como control, las células se trataron con 50 μg/ml de ampicilina (Amp), que inhibe la síntesis de la pared celular bacteriana. Los análisis se realizaron por triplicado.
Para descifrar el mecanismo de acción de la citotoxicidad causada por compuestos relacionados con la uramida, reanalizamos derivados del ácido urbénico con efectos inhibitorios moderados, como se muestra en la imagen. Como se muestra en las Figuras 2b, 6a, las plántulas cultivadas en placas de agar que contenían altas concentraciones (200 μM) de ácido urmotónico 6 produjeron raíces más cortas y curvadas hacia la izquierda (θ = – 23,7 ± 6,1), mientras que las plántulas cultivadas en el medio de control produjeron raíces casi rectas (θ = – 3,8 ± 7,1). Se sabe que este crecimiento oblicuo característico resulta de la disfunción de los microtúbulos corticales14,18. De acuerdo con este hallazgo, los fármacos desestabilizadores de microtúbulos disopiramida y orizalina indujeron una inclinación de la raíz similar bajo nuestras condiciones de crecimiento (Figs. 2b, 6a). Al mismo tiempo, probamos derivados del ácido urmotónico y seleccionamos varios de ellos que, a ciertas concentraciones, indujeron un crecimiento oblicuo de la raíz. Los compuestos 8, 9 y 15 cambiaron la dirección del crecimiento de la raíz a 75 μM, 50 μM y 40 μM, respectivamente, lo que indica que estos compuestos pueden desestabilizar eficazmente los microtúbulos (Fig. 2b, 6a). También probamos el derivado de ácido ursólico más potente, KAND 11, a una concentración más baja (15 µM) y encontramos que la aplicación de KAND 11 inhibió el crecimiento de la raíz y que la dirección del crecimiento de la raíz fue desigual, aunque tendieron a inclinarse hacia la izquierda (Figura C3). . Debido a que concentraciones más altas de fármacos desestabilizadores de microtúbulos a veces inhiben el crecimiento de la planta en lugar de causar inclinación de la raíz, posteriormente evaluamos la posibilidad de que KAND 11 afecte a los microtúbulos observando los microtúbulos corticales en las células epidérmicas de la raíz. La inmunohistoquímica con anticuerpos anti-β-tubulina en células epidérmicas de raíces de plántulas tratadas con 25 μM de KAND 11 mostró la desaparición de casi todos los microtúbulos corticales en las células epidérmicas de la zona de elongación (Fig. 6b). Estos resultados indican que el ácido kumamotonico y sus derivados actúan directa o indirectamente sobre los microtúbulos para alterarlos, y que estos compuestos son nuevos inhibidores de microtúbulos.
El ácido ursónico y sus derivados alteran los microtúbulos corticales en Arabidopsis thaliana. (a) Ángulo de inclinación de la raíz medido en presencia de varios derivados del ácido ursónico en las concentraciones indicadas. También se analizaron los efectos de dos compuestos conocidos por inhibir los microtúbulos: disopiramida y orizalina. El recuadro muestra el estándar utilizado para medir el ángulo de crecimiento de la raíz. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba t, p< 0,05). n>19. Barra de escala = 1 cm. (b) Microtúbulos corticales en células epidérmicas en la zona de elongación. Los microtúbulos en raíces de Arabidopsis Col de tipo silvestre cultivadas en placas MS con o sin 25 μM de KAND 11 se visualizaron mediante tinción inmunohistoquímica utilizando anticuerpos primarios de β-tubulina y anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor. Barra de escala = 10 µm. (c) Estructura mitótica de los microtúbulos en el meristemo radicular. Los microtúbulos se visualizaron mediante tinción inmunohistoquímica. Las estructuras mitóticas, incluidas las zonas de profase, los husos y los fragmoplastos, se contaron a partir de imágenes confocales. Las flechas indican estructuras de microtúbulos mitóticos. Los asteriscos indican diferencias significativas con el tratamiento simulado (prueba t, p< 0,05). n>9. Escala gráfica = 50 µm.
Aunque Ursa tiene la capacidad de alterar la función de los microtúbulos, se espera que su mecanismo de acción sea diferente al de los agentes despolimerizadores de microtúbulos típicos. Por ejemplo, concentraciones más altas de agentes despolimerizadores de microtúbulos como la disopiramida y la orizalina inducen una expansión anisotrópica de las células epidérmicas, mientras que KAND 11 no lo hace. Además, la coaplicación de KAND 11 y disopiramida resultó en una respuesta combinada de crecimiento de la raíz inducida por disopiramida y se observó una inhibición del crecimiento inducida por KAND 11 (Fig. S4). También analizamos la respuesta del mutante hipersensible a la disopiramida 1-1 (phs1-1) a KAND 11. phs1-1 tiene una mutación puntual no canónica de la tubulina quinasa y produce raíces más cortas cuando se trata con disopiramida9,20. Las plántulas mutantes phs1-1 cultivadas en medio de agar que contenía KAND 11 tenían raíces más cortas similares a las cultivadas en disopiramida (fig. S5).
Además, observamos estructuras de microtúbulos mitóticos, como zonas de profase, husos y fragmoplastos, en el meristemo radicular de plántulas tratadas con KAND 11. De acuerdo con las observaciones para CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, se observó una disminución significativa en el número de microtúbulos mitóticos (Fig. 6c).
Para caracterizar la citotoxicidad de KAND 11 a resolución subcelular, tratamos células de suspensión de tabaco BY-2 con KAND 11 y observamos su respuesta. Primero agregamos KAND 11 a células BY-2 que expresaban TagRFP-TUA6, que marca fluorescentemente los microtúbulos, para evaluar el efecto de KAND 11 en los microtúbulos corticales. La densidad de microtúbulos corticales se evaluó mediante análisis de imágenes, que cuantificó el porcentaje de píxeles del citoesqueleto entre los píxeles citoplasmáticos. Los resultados del ensayo mostraron que después del tratamiento con 50 μM o 100 μM de KAND 11 durante 1 hora, la densidad disminuyó significativamente a 0,94 ± 0,74% o 0,23 ± 0,28%, respectivamente, mientras que la densidad de las células tratadas con DMSO ascendió a 1,61 ± 0,34% (Fig. 7a). Estos resultados son consistentes con la observación en Arabidopsis de que el tratamiento con KAND 11 induce la despolimerización de los microtúbulos corticales (Fig. 6b). También examinamos la línea BY-2 con filamentos de actina marcados con GFP-ABD después del tratamiento con la misma concentración de KAND 11 y observamos que el tratamiento con KAND 11 alteró los filamentos de actina. El tratamiento con 50 μM o 100 μM de KAND 11 durante 1 h redujo significativamente la densidad de filamentos de actina a 1,20 ± 0,62% o 0,61 ± 0,26%, respectivamente, mientras que la densidad en células tratadas con DMSO fue de 1,69 ± 0,51% (Fig. 2). 7b). Estos resultados contrastan con los efectos de la propizamida, que no afecta a los filamentos de actina, y la latrunculina B, un despolimerizador de actina que no afecta a los microtúbulos (Figura S6 del SI). Además, el tratamiento con cumamonamida 1, ácido cumamonamida 6 o KAND 11 no afectó a los microtúbulos en células HeLa (Figura S7 del SI). Por lo tanto, se cree que el mecanismo de acción de KAND 11 es diferente al de los disruptores del citoesqueleto conocidos. Además, nuestra observación microscópica de células BY-2 tratadas con KAND 11 reveló el inicio de la muerte celular durante el tratamiento con KAND 11 y mostró que la proporción de células muertas teñidas con azul de Evans no aumentó significativamente después de 30 minutos de tratamiento con KAND 11, mientras que después de 90 minutos de tratamiento con 50 μM o 100 μM de KAND, el número de células muertas aumentó al 43,7% o al 80,1%, respectivamente (Fig. 7c). En conjunto, estos datos indican que el nuevo derivado del ácido ursólico KAND 11 es un inhibidor del citoesqueleto específico de plantas con un mecanismo de acción previamente desconocido.
KAND afecta los microtúbulos corticales, los filamentos de actina y la viabilidad de las células BY-2 de tabaco. (a) Visualización de los microtúbulos corticales en células BY-2 en presencia de TagRFP-TUA6. Las células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO se examinaron mediante microscopía confocal. La densidad de microtúbulos corticales se calculó a partir de micrografías de 25 células independientes. Las letras indican diferencias significativas (prueba HSD de Tukey, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (b) Filamentos de actina cortical en células BY-2 visualizados en presencia de GFP-ABD2. Las células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO se examinaron mediante microscopía confocal. La densidad de filamentos de actina cortical se calculó a partir de micrografías de 25 células independientes. Las letras indican diferencias significativas (prueba HSD de Tukey, p< 0,05). Barra de escala = 10 µm. (c) Observación de células BY-2 muertas mediante tinción con azul de Evans. Las células BY-2 tratadas con KAND 11 (50 μM o 100 μM) o DMSO se examinaron mediante microscopía de campo claro. n=3. Barra de escala = 100 µm.
El descubrimiento y la aplicación de nuevos productos naturales han propiciado avances significativos en diversos aspectos de la vida humana, incluyendo la medicina y la agricultura. Históricamente, se han realizado investigaciones para obtener compuestos útiles a partir de recursos naturales. En particular, se sabe que los actinomicetos son útiles como antibióticos antiparasitarios para nematodos debido a su capacidad para producir diversos metabolitos secundarios como la avermectina, el compuesto principal de la ivermectina y la bleomicina y sus derivados, utilizados medicinalmente como agentes anticancerígenos21,22. Asimismo, se han descubierto diversos compuestos herbicidas en actinomicetos, algunos de los cuales ya se utilizan comercialmente1,23. Por lo tanto, el análisis de los metabolitos de actinomicetos para aislar productos naturales con las actividades biológicas deseadas se considera una estrategia eficaz. En este estudio, descubrimos un nuevo compuesto, la cumamonamida, de S. werraensis y lo sintetizamos con éxito. El ácido ursónico es un intermediario sintético de la urbenamida y sus derivados. Puede provocar el rizado característico de las raíces, exhibir una actividad herbicida de moderada a fuerte y dañar directa o indirectamente los microtúbulos de las plantas. Sin embargo, el mecanismo de acción del ácido urmotónico puede diferir del de los inhibidores de microtúbulos existentes, ya que KAND 11 también interrumpe los filamentos de actina y causa la muerte celular, lo que sugiere un mecanismo regulador mediante el cual el ácido urmotónico y sus derivados influyen en una amplia gama de estructuras del citoesqueleto.
Una caracterización más detallada del ácido urbenónico ayudará a comprender mejor su mecanismo de acción. En particular, el siguiente objetivo es evaluar la capacidad del ácido ursónico para unirse a los microtúbulos reducidos y determinar si actúa directamente sobre ellos, despolimerizándolos, o si su acción provoca su desestabilización. Además, en los casos en que los microtúbulos no sean un objetivo directo, identificar el sitio de acción y las dianas moleculares del ácido ursónico en las células vegetales contribuirá a comprender mejor las propiedades de los compuestos relacionados y las posibles maneras de mejorar su actividad herbicida. Nuestro ensayo de bioactividad reveló la singular capacidad citotóxica del ácido ursónico sobre el crecimiento de plantas como Arabidopsis thaliana, tabaco y hepática, sin afectar a E. coli ni a las células HeLa. La escasa o nula toxicidad para las células animales representa una ventaja de los derivados del ácido ursónico si se desarrollan como herbicidas para su uso en campos agrícolas abiertos. De hecho, dado que los microtúbulos son estructuras comunes en eucariotas, su inhibición selectiva en plantas es un requisito clave para los herbicidas. Por ejemplo, la propizamida, un agente despolimerizador de microtúbulos que se une directamente a la tubulina e inhibe la polimerización, se utiliza como herbicida debido a su baja toxicidad para las células animales24. A diferencia de la disopiramida, las benzamidas relacionadas tienen especificidades de diana diferentes. Además de los microtúbulos de las plantas, el RH-4032 o la benzoxamida también inhiben los microtúbulos de las células animales o de los oomicetos, respectivamente, y la zalilamida se utiliza como fungicida debido a su baja fitotoxicidad25,26,27. El oso recientemente descubierto y sus derivados exhiben citotoxicidad selectiva contra las plantas, pero cabe destacar que modificaciones adicionales podrían alterar su especificidad de diana, lo que potencialmente proporcionaría derivados adicionales para el control de hongos patógenos u oomicetos.
Las propiedades únicas del ácido urbenónico y sus derivados son útiles para su desarrollo como herbicidas y su uso como herramientas de investigación. La importancia del citoesqueleto en el control de la forma de las células vegetales es ampliamente reconocida. Estudios anteriores han demostrado que las plantas han desarrollado mecanismos complejos de organización de los microtúbulos corticales mediante el control de la dinámica de los microtúbulos para controlar adecuadamente la morfogénesis. Se ha identificado un gran número de moléculas responsables de la regulación de la actividad de los microtúbulos, y la investigación relacionada aún continúa3,4,28. Nuestra comprensión actual de la dinámica de los microtúbulos en las células vegetales no explica completamente los mecanismos de organización de los microtúbulos corticales. Por ejemplo, aunque tanto la disopiramida como la orizalina pueden despolimerizar los microtúbulos, la disopiramida causa una distorsión radicular severa, mientras que la orizalina tiene un efecto relativamente leve. Además, las mutaciones en la tubulina, que estabiliza los microtúbulos, también causan dextrorrotación en las raíces, mientras que el paclitaxel, que también estabiliza la dinámica de los microtúbulos, no lo hace. Por lo tanto, el estudio y la identificación de las dianas moleculares del ácido ursólico deberían aportar nuevos conocimientos sobre la regulación de los microtúbulos corticales de las plantas. Asimismo, futuras comparaciones entre sustancias químicas eficaces para promover el crecimiento anómalo, como la disopiramida, y otras menos eficaces, como la orizalina o el ácido kumamotérico, proporcionarán pistas sobre cómo se produce dicho crecimiento anómalo.
Por otro lado, las reorganizaciones del citoesqueleto relacionadas con la defensa son otra posibilidad para explicar la citotoxicidad del ácido ursónico. La infección por un patógeno o la introducción de un elicitor en las células vegetales a veces causa la destrucción del citoesqueleto y la consiguiente muerte celular29. Por ejemplo, se ha informado que la criptoxantina derivada de oomicetos altera los microtúbulos y los filamentos de actina antes de la muerte celular del tabaco, de forma similar a lo que ocurre con el tratamiento con KAND30,31. Las similitudes entre las respuestas de defensa y las respuestas celulares inducidas por el ácido ursónico nos llevaron a plantear la hipótesis de que desencadenan procesos celulares comunes, aunque es evidente un efecto más rápido y fuerte del ácido ursónico que de la criptoxantina. Sin embargo, los estudios han demostrado que la alteración de los filamentos de actina promueve la muerte celular espontánea, que no siempre va acompañada de la alteración de los microtúbulos29. Además, queda por ver si el patógeno o el elicitor causan un crecimiento radicular distorsionado, como lo hacen los derivados del ácido ursónico. Por lo tanto, el conocimiento molecular que vincula las respuestas de defensa con el citoesqueleto constituye un problema atractivo que merece ser abordado. Aprovechando la presencia de compuestos de bajo peso molecular relacionados con el ácido ursónico, así como una variedad de derivados con potencias variables, se podrían ofrecer oportunidades para atacar mecanismos celulares desconocidos.
En conjunto, el descubrimiento y la aplicación de nuevos compuestos que modulan la dinámica de los microtúbulos proporcionarán métodos eficaces para abordar los complejos mecanismos moleculares que subyacen a la determinación de la forma de las células vegetales. En este contexto, el ácido urmotónico, un compuesto desarrollado recientemente que afecta a los microtúbulos y los filamentos de actina e induce la muerte celular, podría ofrecer la oportunidad de descifrar la conexión entre el control de los microtúbulos y estos otros mecanismos. Por lo tanto, el análisis químico y biológico mediante el ácido urbenónico nos ayudará a comprender los mecanismos de regulación molecular que controlan el citoesqueleto vegetal.
Inocule S. werraensis MK493-CF1 en un matraz Erlenmeyer de 500 mL con deflectores que contenga 110 mL de medio de siembra compuesto por 2% (p/v) de galactosa, 2% (p/v) de pasta Essence, 1% (p/v) de composición Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (p/v) de extracto de maíz (KOGOSTCH Co., Ltd., Japón), 0,2% (p/v) de (NH4)2SO4 y 0,2% de CaCO3 en agua desionizada. (pH 7,4 antes de la esterilización). Los cultivos de siembra se incubaron en un agitador rotatorio (180 rpm) a 27 °C durante 2 días. Cultivo de producción mediante fermentación en estado sólido. El cultivo inicial (7 ml) se transfirió a un matraz K-1 de 500 ml que contenía 40 g de medio de producción compuesto por 15 g de cebada prensada (MUSO Co., Ltd., Japón) y 25 g de agua desionizada (pH no ajustado antes de la esterilización). La fermentación se llevó a cabo a 30 °C en la oscuridad durante 14 días. El material de fermentación se extrajo con 40 ml/botella de EtOH y se centrifugó (1500 g, 4 °C, 10 min). El sobrenadante del cultivo (60 ml) se extrajo con una mezcla de MeOH/EtOAc al 10 %. La capa orgánica se evaporó a presión reducida para obtener un residuo (59,5 mg), que se sometió a HPLC con elución en gradiente (0–10 minutos: 90%) en una columna de fase inversa (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, DI 10 mm × longitud 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minutos: 90% H2O/CH3CN a 70% H2O/CH3CN (gradiente), 35–45 minutos: 90% H2O/EtOH, 45–155 minutos: 90% H2O/EtOH a 100% EtOH (gradiente (gradiente), 155–200 min: 100% EtOH) a un caudal de 1,5 ml/min, se aisló cumamonamida (1, 36,0 mg) como un polvo amorfo blanco.
Kumamotoamida(1); RMN de 1H (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); RMN de 13C (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor calculado: 141.0659, valor medido: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Las semillas de Columbia (Col-0) se obtuvieron del Centro de Recursos Biológicos de Arabidopsis (ABRC) con permiso para su uso en investigación. Las semillas Col-0 se propagaron y mantuvieron en nuestras condiciones de laboratorio y se utilizaron como plantas de Arabidopsis de tipo silvestre. Las semillas de Arabidopsis se esterilizaron superficialmente y se cultivaron en medio Murashige y Skoog a media concentración que contenía 2 % de sacarosa (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (p/v) de ácido 2-(4-morfolino)etanosulfónico (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) y 1,5 % de agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, a 23 °C y luz constante. Las semillas del mutante phs1-1 fueron proporcionadas por T. Hashimoto (Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara).
Las semillas de la cepa SR-1 fueron proporcionadas por T. Hashimoto (Instituto de Ciencia y Tecnología de Nara) y se utilizaron como plantas de tabaco de tipo silvestre. Las semillas de tabaco se esterilizaron superficialmente y se remojaron en agua estéril durante tres noches para promover la germinación, luego se colocaron en una solución de concentración reducida que contenía 2 % de sacarosa, 0,05 % (p/v) de MES y 0,8 % de goma gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) (medio Murashige y Skoog) con pH 5,7 y se incubaron a 23 °C bajo luz constante.
La cepa Tak-1 fue proporcionada por T. Kohchi (Universidad de Kioto) y se utilizó como unidad experimental estándar para el estudio de las hepáticas. Gemma se obtuvo de plantas cultivadas esterilizadas y luego se sembró en medio Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) que contenía 1 % de sacarosa y 0,3 % de goma gelana, y se incubó a 23 °C bajo luz continua.
Las células de tabaco BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) fueron proporcionadas por S. Hasezawa (Universidad de Tokio). Las células BY-2 se diluyeron 95 veces en medio Linsmeier y Skoog modificado y se suplementaron semanalmente con ácido 2,4-diclorofenoxiacético 32. La suspensión celular se mezcló en un agitador rotatorio a 130 rpm a 27 °C en la oscuridad. Las células se lavaron con 10 veces el volumen de medio fresco y se resuspendieron en el mismo medio. Las líneas celulares transgénicas BY-2 que expresan de forma estable el marcador de microtúbulos TagRFP-TUA6 o el marcador de filamentos de actina GFP-ABD2 bajo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor se generaron como se describe33,34,35. Estas líneas celulares se pueden mantener y sincronizar utilizando procedimientos similares a los utilizados para la línea celular BY-2 original.
Las células HeLa se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) suplementado con 10 % de suero fetal bovino, 1,2 U/ml de penicilina y 1,2 μg/ml de estreptomicina en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2.
Todos los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con las normas y directrices japonesas de bioseguridad.
Los compuestos se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) como soluciones madre y se diluyeron en medio MS para Arabidopsis y tabaco o en medio Gamborg B5 para hepáticas. Para el ensayo de inhibición del crecimiento de la raíz, se sembraron más de 10 semillas por placa en medio de agar que contenía los compuestos indicados o DMSO. Las semillas se incubaron en una cámara de crecimiento durante 7 días. Se fotografiaron las plántulas y se midió la longitud de las raíces. Para el ensayo de germinación de Arabidopsis, se sembraron 48 semillas por placa en medio de agar que contenía 200 μM del compuesto o DMSO. Las semillas de Arabidopsis se cultivaron en una cámara de crecimiento y se contó el número de plántulas germinadas 7 días después de la germinación (dag). Para el ensayo de germinación de tabaco, se sembraron 24 semillas por placa en medio de agar que contenía 200 μM de KAND o DMSO. Las semillas de tabaco se cultivaron en una cámara de crecimiento y se contó el número de plántulas germinadas después de 14 días. Para el ensayo de inhibición del crecimiento de las hepáticas, se sembraron 9 embriones de cada placa en un medio de agar que contenía las concentraciones indicadas de KAND o DMSO y se incubaron en una cámara de crecimiento durante 14 días.
Utilice plántulas teñidas con 5 mg/ml de yoduro de propidio (PI) para visualizar la organización del meristemo radicular. Las señales de PI se observaron mediante microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio confocal de barrido láser TCS SPE (Leica Microsystems).
La tinción histoquímica de las raíces con β-glucuronidasa (GUS) se realizó según el protocolo descrito por Malami y Benfey36. Las plántulas se fijaron en acetona al 90% durante la noche, se tiñeron con 0,5 mg/ml de ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-glucurónico en tampón GUS durante 1 hora y se colocaron en una solución de cloraldehído hidratado (8 g de hidrato de cloral, 2 ml de agua y 1 ml de glicerol) y se observaron mediante microscopía de contraste de interferencia diferencial utilizando un microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Se midieron los ángulos de las raíces en plántulas de 7 días de edad cultivadas en placas colocadas verticalmente. Mida el ángulo de la raíz con respecto a la dirección del vector de gravedad, como se describe en el paso 6.
La disposición de los microtúbulos corticales se observó como se describió, con pequeñas modificaciones al protocolo 37. Se utilizaron anticuerpos anti-β-tubulina (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) y anti-IgG de ratón conjugados con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) como anticuerpos primario y secundario a diluciones de 1:1000 y 1:100, respectivamente. Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un microscopio confocal de barrido láser TCS SPE (Leica Microsystems). Adquiera imágenes de pila Z y cree proyecciones de máxima intensidad según las instrucciones del fabricante.
El ensayo de proliferación de células HeLa se realizó utilizando el kit Cell Counting Kit 8 (Dojindo) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El crecimiento de E. coli DH5α se analizó midiendo la densidad celular en el cultivo mediante un espectrofotómetro a 600 nm (OD600).
La organización del citoesqueleto en células transgénicas BY-2 se observó mediante un microscopio de fluorescencia equipado con un dispositivo de escaneo confocal CSU-X1 (Yokogawa) y una cámara sCMOS (Zyla, Andor Technology). La densidad del citoesqueleto se evaluó mediante análisis de imagen, que cuantificó el porcentaje de píxeles del citoesqueleto entre los píxeles citoplasmáticos en las imágenes confocales utilizando el software ImageJ, como se describe en las referencias 38 y 39.
Para detectar la muerte celular en células BY-2, se incubó una alícuota de la suspensión celular con azul de Evans al 0,05 % durante 10 minutos a temperatura ambiente. La tinción selectiva con azul de Evans de las células muertas depende de la extrusión del colorante de las células viables a través de la membrana plasmática intacta40. Las células teñidas se observaron con un microscopio de campo claro (BX53, Olympus).
Las células HeLa se cultivaron en DMEM suplementado con 10% de FBS en una incubadora humidificada a 37°C y 5% de CO2. Las células se trataron con 100 μM de KAND 11, ácido kumamonámico 6, kumamonamida 1, 100 ng/ml de colcemida (Gibco) o 100 ng/ml de Nocodmaze (Sigma) durante 6 h a 37°C. Las células se fijaron con MetOH durante 10 min y luego con acetato durante 5 min a temperatura ambiente. Las células fijadas se incubaron con el anticuerpo primario de β-tubulina (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluido en 0,5% de BSA/PBS durante 2 horas, se lavaron 3 veces con TBST y luego se incubaron con el anticuerpo de cabra Alexa Fluor. 488 1 hora. Se utilizaron anticuerpos IgG de ratón (Thermo Fisher Scientific: A11001) y 15 ng/ml de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluidos en BSA al 0,5 % en PBS. Tras lavar las células tres veces con TBST, se observaron bajo un microscopio invertido Nikon Eclipse Ti-E. Las imágenes se capturaron con una cámara CCD refrigerada Hamamatsu ORCA-R2 mediante el software MetaMorph (Molecular Devices).
Fecha de publicación: 17 de junio de 2024
