En este estudio se evaluaron los efectos estimulantes del tratamiento combinado dereguladores del crecimiento de las plantasSe investigó el efecto de las nanopartículas de óxido de hierro (2,4-D y kinetina) y de óxido de hierro (Fe₃O₄-NPs) sobre la morfogénesis in vitro y la producción de metabolitos secundarios en *Hypericum perforatum* L. El tratamiento optimizado [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetina (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] mejoró significativamente los parámetros de crecimiento de la planta: la altura de la planta aumentó un 59,6%, la longitud de la raíz un 114,0%, el número de yemas un 180,0% y el peso fresco del callo un 198,3% en comparación con el grupo control. Este tratamiento combinado también mejoró la eficiencia de regeneración (50,85%) y aumentó el contenido de hipericina un 66,6%. El análisis GC-MS reveló altos contenidos de hiperósido, β-patoleno y alcohol cetílico, que representan el 93,36 % del área total del pico, mientras que el contenido de fenólicos y flavonoides totales aumentó hasta un 80,1 %. Estos resultados indican que los reguladores del crecimiento vegetal (PGR) y las nanopartículas de Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NP) ejercen un efecto sinérgico al estimular la organogénesis y la acumulación de compuestos bioactivos, lo que representa una estrategia prometedora para el mejoramiento biotecnológico de plantas medicinales.
La hierba de San Juan (Hypericum perforatum L.), también conocida como hipérico, es una planta herbácea perenne de la familia Hypericaceae con valor económico.[1] Sus posibles componentes bioactivos incluyen taninos naturales, xantonas, floroglucinol, naftalendiantrona (hiperina y pseudohiperina), flavonoides, ácidos fenólicos y aceites esenciales.[2,3,4] La hierba de San Juan puede propagarse mediante métodos tradicionales; sin embargo, la estacionalidad de estos métodos, la baja germinación de las semillas y la susceptibilidad a enfermedades limitan su potencial para el cultivo a gran escala y la formación continua de metabolitos secundarios.[1,5,6]
Por lo tanto, el cultivo de tejidos in vitro se considera un método eficaz para la propagación rápida de plantas, la conservación de recursos de germoplasma y el aumento de la producción de compuestos medicinales [7, 8]. Los reguladores del crecimiento vegetal (RCV) desempeñan un papel crucial en la regulación de la morfogénesis y son necesarios para el cultivo in vitro de callos y organismos completos. La optimización de sus concentraciones y combinaciones es crucial para el éxito de estos procesos de desarrollo [9]. Por lo tanto, comprender la composición y concentración adecuadas de los reguladores es importante para mejorar el crecimiento y la capacidad regenerativa de la hierba de San Juan (H. perforatum) [10].
Las nanopartículas de óxido de hierro (Fe₃O₄) son una clase de nanopartículas que se han desarrollado o se están desarrollando para el cultivo de tejidos. El Fe₃O₄ posee importantes propiedades magnéticas, buena biocompatibilidad y la capacidad de promover el crecimiento vegetal y reducir el estrés ambiental, por lo que ha atraído considerable atención en el diseño de cultivos de tejidos. Entre las posibles aplicaciones de estas nanopartículas se incluyen la optimización del cultivo in vitro para promover la división celular, mejorar la absorción de nutrientes y activar enzimas antioxidantes [11].
Aunque las nanopartículas han mostrado buenos efectos promotores del crecimiento vegetal, los estudios sobre la aplicación combinada de nanopartículas de Fe₃O₄ y reguladores optimizados del crecimiento vegetal en *H. perforatum* siguen siendo escasos. Para llenar este vacío de conocimiento, este estudio evaluó los efectos de sus efectos combinados en la morfogénesis in vitro y la producción de metabolitos secundarios para proporcionar nuevos conocimientos para mejorar las características de las plantas medicinales. Por lo tanto, este estudio tiene dos objetivos: (1) optimizar la concentración de reguladores del crecimiento vegetal para promover eficazmente la formación de callos, la regeneración de brotes y el enraizamiento in vitro; y (2) evaluar los efectos de las nanopartículas de Fe₃O₄ en los parámetros de crecimiento in vitro. Los planes futuros incluyen evaluar la tasa de supervivencia de las plantas regeneradas durante la aclimatación (in vitro). Se espera que los resultados de este estudio mejoren significativamente la eficiencia de la micropropagación de *H. perforatum*, contribuyendo así al uso sostenible y las aplicaciones biotecnológicas de esta importante planta medicinal.
En este estudio, obtuvimos explantos foliares de plantas anuales de hipérico cultivadas en campo (plantas madre). Estos explantos se utilizaron para optimizar las condiciones de cultivo in vitro. Antes del cultivo, las hojas se enjuagaron a fondo con agua destilada corriente durante varios minutos. A continuación, las superficies de los explantos se desinfectaron mediante inmersión en etanol al 70 % durante 30 segundos, seguida de una inmersión en una solución de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1,5 % con unas gotas de Tween 20 durante 10 minutos. Finalmente, los explantos se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril antes de transferirlos al siguiente medio de cultivo.
Durante las cuatro semanas siguientes, se midieron los parámetros de regeneración de los brotes, incluyendo la tasa de regeneración, el número de brotes por explante y su longitud. Cuando los brotes regenerados alcanzaron una longitud de al menos 2 cm, se transfirieron a un medio de enraizamiento compuesto por medio MS a la mitad de su concentración, 0,5 mg/L de ácido indolbutírico (AIB) y 0,3% de goma guar. El cultivo de enraizamiento se prolongó durante tres semanas, durante las cuales se midieron la tasa de enraizamiento, el número de raíces y su longitud. Cada tratamiento se repitió tres veces, cultivando 10 explantes por réplica, lo que produjo aproximadamente 30 explantes por tratamiento.
La altura de la planta se midió en centímetros (cm) con una regla, desde la base hasta la punta de la hoja más alta. La longitud de la raíz se midió en milímetros (mm) inmediatamente después de retirar cuidadosamente las plántulas y el sustrato. El número de yemas por explante se contó directamente en cada planta. El número de manchas negras en las hojas, conocidas como nódulos, se midió visualmente. Se cree que estos nódulos negros son glándulas que contienen hipericina, o manchas oxidativas, y se utilizan como indicador fisiológico de la respuesta de la planta al tratamiento. Después de retirar todo el sustrato, se midió el peso fresco de las plántulas con una báscula electrónica con una precisión de miligramos (mg).
El método para calcular la tasa de formación de callos es el siguiente: tras cultivar explantos en un medio con diversos reguladores de crecimiento (quinasas, 2,4-D y Fe₃O₄) durante cuatro semanas, se cuenta el número de explantos capaces de formar callos. La fórmula para calcular la tasa de formación de callos es la siguiente:
Cada tratamiento se repitió tres veces y se examinaron al menos 10 explantos en cada repetición.
La tasa de regeneración refleja la proporción de tejido calloso que completa con éxito el proceso de diferenciación de la yema tras la etapa de formación del callo. Este indicador demuestra la capacidad del tejido calloso para transformarse en tejido diferenciado y convertirse en nuevos órganos vegetales.
El coeficiente de enraizamiento es la relación entre el número de ramas capaces de enraizar y el número total de ramas. Este indicador refleja el éxito de la etapa de enraizamiento, crucial en la micropropagación y la propagación de plantas, ya que un buen enraizamiento contribuye a una mejor supervivencia de las plántulas en condiciones de cultivo.
Los compuestos de hipericina se extrajeron con metanol al 90 %. Se añadieron 50 mg de material vegetal seco a 1 ml de metanol y se sonicó durante 20 min a 30 kHz en un limpiador ultrasónico (modelo A5120-3YJ) a temperatura ambiente y en oscuridad. Tras la sonicación, la muestra se centrifugó a 6000 rpm durante 15 min. Se recogió el sobrenadante y se midió la absorbancia de la hipericina a 592 nm con un espectrofotómetro Plus-3000 S, según el método descrito por Conceiçao et al. [14].
La mayoría de los tratamientos con reguladores del crecimiento vegetal (PGR) y nanopartículas de óxido de hierro (Fe₃O₄-NP) no indujeron la formación de nódulos negros en las hojas de los brotes regenerados. No se observaron nódulos en ninguno de los tratamientos con 0,5 o 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 o 1 mg/L de kinetina, o 1, 2 o 4 mg/L de nanopartículas de óxido de hierro. Algunas combinaciones mostraron un ligero aumento en el desarrollo de nódulos (pero no estadísticamente significativo) a concentraciones más altas de kinetina y/o nanopartículas de óxido de hierro, como la combinación de 2,4-D (0,5–2 mg/L) con kinetina (1–1,5 mg/L) y nanopartículas de óxido de hierro (2–4 mg/L). Estos resultados se muestran en la Figura 2. Los nódulos negros representan glándulas ricas en hipericina, tanto naturales como beneficiosas. En este estudio, los nódulos negros se asociaron principalmente con el oscurecimiento de los tejidos, lo que indica un entorno favorable para la acumulación de hipericina. El tratamiento con nanopartículas de 2,4-D, kinetina y Fe₃O₄ promovió el crecimiento del callo, redujo el oscurecimiento y aumentó el contenido de clorofila, lo que sugiere una mejor función metabólica y una posible reducción del daño oxidativo [37]. Este estudio evaluó los efectos de la kinetina en combinación con nanopartículas de 2,4-D y Fe₃O₄ en el crecimiento y desarrollo del callo de hipérico (Fig. 3a–g). Estudios previos han demostrado que las nanopartículas de Fe₃O₄ tienen actividades antifúngicas y antimicrobianas [38, 39] y, cuando se usan en combinación con reguladores del crecimiento vegetal, pueden estimular los mecanismos de defensa de las plantas y reducir los índices de estrés celular [18]. Aunque la biosíntesis de metabolitos secundarios está regulada genéticamente, su rendimiento real depende en gran medida de las condiciones ambientales. Los cambios metabólicos y morfológicos pueden influir en los niveles de metabolitos secundarios al regular la expresión de genes específicos de la planta y responder a factores ambientales. Además, los inductores pueden desencadenar la activación de nuevos genes, que a su vez estimulan la actividad enzimática, activando múltiples vías biosintéticas y conduciendo a la formación de metabolitos secundarios. Además, otro estudio demostró que la reducción del sombreado aumenta la exposición a la luz solar, elevando así las temperaturas diurnas en el hábitat natural de *Hypericum perforatum*, lo que también contribuye a un mayor rendimiento de hipericina. Con base en estos datos, este estudio investigó el papel de las nanopartículas de hierro como posibles inductores en cultivos de tejidos. Los resultados mostraron que estas nanopartículas pueden activar genes involucrados en la biosíntesis de hesperidina mediante estimulación enzimática, lo que conduce a una mayor acumulación de este compuesto (Fig. 2). Por lo tanto, en comparación con las plantas que crecen en condiciones naturales, se puede argumentar que la producción de dichos compuestos in vivo también puede mejorarse cuando se combina un estrés moderado con la activación de genes involucrados en la biosíntesis de metabolitos secundarios. Los tratamientos combinados generalmente tienen un efecto positivo en la tasa de regeneración, pero en algunos casos, este efecto se debilita. Notablemente, el tratamiento con 1 mg/L de 2,4-D, 1,5 mg/L de quinasa y diferentes concentraciones podría aumentar de forma independiente y significativa la tasa de regeneración en un 50,85% en comparación con el grupo de control (Fig. 4c). Estos resultados sugieren que las combinaciones específicas de nanohormonas pueden actuar sinérgicamente para promover el crecimiento de las plantas y la producción de metabolitos, lo cual es de gran importancia para el cultivo de tejidos de plantas medicinales. Palmer y Keller [50] demostraron que el tratamiento con 2,4-D podría inducir de forma independiente la formación de callos en St. perforatum, mientras que la adición de quinasa mejoró significativamente la formación de callos y la regeneración. Este efecto se debió a la mejora del equilibrio hormonal y la estimulación de la división celular. Bal et al. [51] encontraron que el tratamiento con Fe₃O₄-NP podría mejorar de forma independiente la función de las enzimas antioxidantes, promoviendo así el crecimiento de las raíces en St. perforatum. Los medios de cultivo que contienen nanopartículas de Fe₃O₄ en concentraciones de 0,5 mg/L, 1 mg/L y 1,5 mg/L mejoraron la tasa de regeneración de las plantas de lino [52]. El uso de kinetina, 2,4-diclorobenzotiazolinona y nanopartículas de Fe₃O₄ mejoró significativamente las tasas de formación de callos y raíces; sin embargo, deben considerarse los posibles efectos secundarios del uso de estas hormonas para la regeneración in vitro. Por ejemplo, el uso a largo plazo o en altas concentraciones de 2,4-diclorobenzotiazolinona o kinetina puede provocar variación clonal somática, estrés oxidativo, morfología anormal del callo o vitrificación. Por lo tanto, una alta tasa de regeneración no predice necesariamente la estabilidad genética. Todas las plantas regeneradas deben evaluarse utilizando marcadores moleculares (p. ej., RAPD, ISSR, AFLP) o análisis citogenético para determinar su homogeneidad y similitud con las plantas in vivo [53,54,55].
Este estudio demostró por primera vez que el uso combinado de reguladores del crecimiento vegetal (2,4-D y kinetina) con nanopartículas de Fe₃O₄ puede mejorar la morfogénesis y la acumulación de metabolitos bioactivos clave (incluyendo hipericina e hiperósido) en *Hypericum perforatum*. El régimen de tratamiento optimizado (1 mg/L de 2,4-D + 1 mg/L de kinetina + 4 mg/L de Fe₃O₄-NP) no solo maximizó la formación de callos, la organogénesis y la producción de metabolitos secundarios, sino que también demostró un leve efecto inductor, mejorando potencialmente la tolerancia al estrés y el valor medicinal de la planta. La combinación de nanotecnología y cultivo de tejidos vegetales proporciona una plataforma sostenible y eficiente para la producción in vitro a gran escala de compuestos medicinales. Estos resultados allanan el camino para aplicaciones industriales y futuras investigaciones en mecanismos moleculares, optimización de dosis y precisión genética, vinculando así la investigación fundamental sobre plantas medicinales con la biotecnología práctica.
Hora de publicación: 12 de diciembre de 2025