En este estudio, los efectos estimulantes del tratamiento combinado dereguladores del crecimiento vegetalSe investigó el efecto de la combinación de 2,4-D y kinetina, así como de nanopartículas de óxido de hierro (Fe₃O₄-NPs), sobre la morfogénesis in vitro y la producción de metabolitos secundarios en *Hypericum perforatum* L. El tratamiento optimizado [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetina (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] mejoró significativamente los parámetros de crecimiento de la planta: la altura aumentó un 59,6%, la longitud de la raíz un 114,0%, el número de yemas un 180,0% y el peso fresco del callo un 198,3% en comparación con el grupo control. Este tratamiento combinado también mejoró la eficiencia de regeneración (50,85%) e incrementó el contenido de hipericina en un 66,6%. El análisis GC-MS reveló altos contenidos de hiperósido, β-patoleno y alcohol cetílico, que representan el 93,36 % del área total del pico, mientras que los contenidos de fenoles y flavonoides totales aumentaron hasta un 80,1 %. Estos resultados indican que los reguladores del crecimiento vegetal (PGR) y las nanopartículas de Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) ejercen un efecto sinérgico al estimular la organogénesis y la acumulación de compuestos bioactivos, lo que representa una estrategia prometedora para la mejora biotecnológica de las plantas medicinales.
La hierba de San Juan (Hypericum perforatum L.), también conocida como hipérico, es una planta herbácea perenne de la familia Hypericaceae que tiene valor económico.[1] Sus componentes bioactivos potenciales incluyen taninos naturales, xantonas, floroglucinol, naftalenediantrona (hiperina y pseudohiperina), flavonoides, ácidos fenólicos y aceites esenciales.[2,3,4] La hierba de San Juan se puede propagar mediante métodos tradicionales; sin embargo, la estacionalidad de estos métodos, la baja germinación de las semillas y la susceptibilidad a las enfermedades limitan su potencial para el cultivo a gran escala y la formación continua de metabolitos secundarios.[1,5,6]
Por lo tanto, el cultivo de tejidos in vitro se considera un método eficaz para la propagación rápida de plantas, la conservación de recursos de germoplasma y el aumento del rendimiento de compuestos medicinales [7, 8]. Los reguladores del crecimiento vegetal (RCV) desempeñan un papel crucial en la regulación de la morfogénesis y son necesarios para el cultivo in vitro de callos y organismos completos. La optimización de sus concentraciones y combinaciones es fundamental para la correcta finalización de estos procesos de desarrollo [9]. Por consiguiente, comprender la composición y concentración adecuadas de los reguladores es importante para mejorar el crecimiento y la capacidad regenerativa de la hierba de San Juan (H. perforatum) [10].
Las nanopartículas de óxido de hierro (Fe₃O₄) son una clase de nanopartículas que se han desarrollado o se están desarrollando para el cultivo de tejidos. El Fe₃O₄ posee importantes propiedades magnéticas, buena biocompatibilidad y la capacidad de promover el crecimiento vegetal y reducir el estrés ambiental, por lo que ha despertado un gran interés en el diseño de cultivos de tejidos. Entre las posibles aplicaciones de estas nanopartículas se incluyen la optimización del cultivo in vitro para promover la división celular, mejorar la absorción de nutrientes y activar las enzimas antioxidantes [11].
Aunque las nanopartículas han demostrado buenos efectos promotores del crecimiento vegetal, los estudios sobre la aplicación combinada de nanopartículas de Fe₃O₄ y reguladores de crecimiento vegetal optimizados en *H. perforatum* siguen siendo escasos. Para llenar esta laguna de conocimiento, este estudio evaluó los efectos de su combinación sobre la morfogénesis in vitro y la producción de metabolitos secundarios, con el fin de aportar nuevas perspectivas para mejorar las características de las plantas medicinales. Por lo tanto, este estudio tiene dos objetivos: (1) optimizar la concentración de reguladores de crecimiento vegetal para promover eficazmente la formación de callos, la regeneración de brotes y el enraizamiento in vitro; y (2) evaluar los efectos de las nanopartículas de Fe₃O₄ sobre los parámetros de crecimiento in vitro. Los planes futuros incluyen la evaluación de la tasa de supervivencia de las plantas regeneradas durante la aclimatación (in vitro). Se espera que los resultados de este estudio mejoren significativamente la eficiencia de la micropropagación de *H. perforatum*, contribuyendo así al uso sostenible y a las aplicaciones biotecnológicas de esta importante planta medicinal.
En este estudio, se obtuvieron explantes de hojas de plantas anuales de hipérico (plantas madre) cultivadas en campo. Estos explantes se utilizaron para optimizar las condiciones de cultivo in vitro. Antes del cultivo, las hojas se enjuagaron minuciosamente con agua destilada corriente durante varios minutos. A continuación, las superficies de los explantes se desinfectaron sumergiéndolas en etanol al 70 % durante 30 segundos, seguido de una inmersión en una solución de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1,5 % con unas gotas de Tween 20 durante 10 minutos. Finalmente, los explantes se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril antes de transferirlos al siguiente medio de cultivo.
Durante las siguientes cuatro semanas, se midieron los parámetros de regeneración de brotes, incluyendo la tasa de regeneración, el número de brotes por explante y la longitud de los brotes. Cuando los brotes regenerados alcanzaron una longitud de al menos 2 cm, se transfirieron a un medio de enraizamiento compuesto por medio MS a media concentración, 0,5 mg/L de ácido indolbutírico (AIB) y 0,3 % de goma guar. El cultivo de enraizamiento continuó durante tres semanas, tiempo durante el cual se midieron la tasa de enraizamiento, el número de raíces y la longitud de las raíces. Cada tratamiento se repitió tres veces, con 10 explantes cultivados por réplica, lo que resultó en aproximadamente 30 explantes por tratamiento.
La altura de la planta se midió en centímetros (cm) con una regla, desde la base hasta la punta de la hoja más alta. La longitud de la raíz se midió en milímetros (mm) inmediatamente después de extraer cuidadosamente las plántulas y retirar el sustrato. El número de yemas por explante se contó directamente en cada planta. El número de manchas negras en las hojas, conocidas como nódulos, se midió visualmente. Se cree que estos nódulos negros son glándulas que contienen hipericina o manchas oxidativas, y se utilizan como indicador fisiológico de la respuesta de la planta al tratamiento. Tras retirar todo el sustrato, el peso fresco de las plántulas se midió con una balanza electrónica con una precisión de miligramos (mg).
El método para calcular la tasa de formación de callo es el siguiente: tras cultivar explantes en un medio que contiene diversos reguladores del crecimiento (quinasas, 2,4-D y Fe3O4) durante cuatro semanas, se cuenta el número de explantes capaces de formar callo. La fórmula para calcular la tasa de formación de callo es la siguiente:
Cada tratamiento se repitió tres veces, examinándose al menos 10 explantes en cada repetición.
La tasa de regeneración refleja la proporción de tejido calloso que completa con éxito el proceso de diferenciación de yemas tras la etapa de formación del callo. Este indicador demuestra la capacidad del tejido calloso para transformarse en tejido diferenciado y desarrollarse en nuevos órganos vegetales.
El coeficiente de enraizamiento es la relación entre el número de ramas capaces de enraizar y el número total de ramas. Este indicador refleja el éxito de la etapa de enraizamiento, crucial en la micropropagación y la propagación de plantas, ya que un buen enraizamiento ayuda a las plántulas a sobrevivir mejor en condiciones de crecimiento.
Los compuestos de hipericina se extrajeron con metanol al 90%. Se añadieron 50 mg de material vegetal seco a 1 ml de metanol y se sonicaron durante 20 min a 30 kHz en un limpiador ultrasónico (modelo A5120-3YJ) a temperatura ambiente en la oscuridad. Tras la sonicación, la muestra se centrifugó a 6000 rpm durante 15 min. Se recogió el sobrenadante y se midió la absorbancia de la hipericina a 592 nm utilizando un espectrofotómetro Plus-3000 S según el método descrito por Conceiçao et al. [14].
La mayoría de los tratamientos con reguladores del crecimiento vegetal (PGR) y nanopartículas de óxido de hierro (Fe₃O₄-NPs) no indujeron la formación de nódulos negros en las hojas de brotes regenerados. No se observaron nódulos en ninguno de los tratamientos con 0,5 o 1 mg/L de 2,4-D, 0,5 o 1 mg/L de kinetina, o 1, 2 o 4 mg/L de nanopartículas de óxido de hierro. Algunas combinaciones mostraron un ligero aumento en el desarrollo de nódulos (pero no estadísticamente significativo) a concentraciones más altas de kinetina y/o nanopartículas de óxido de hierro, como la combinación de 2,4-D (0,5–2 mg/L) con kinetina (1–1,5 mg/L) y nanopartículas de óxido de hierro (2–4 mg/L). Estos resultados se muestran en la Figura 2. Los nódulos negros representan glándulas ricas en hipericina, tanto naturales como beneficiosas. En este estudio, los nódulos negros se asociaron principalmente con el pardeamiento de los tejidos, lo que indica un entorno favorable para la acumulación de hipericina. El tratamiento con 2,4-D, kinetina y nanopartículas de Fe₃O₄ promovió el crecimiento del callo, redujo el pardeamiento y aumentó el contenido de clorofila, lo que sugiere una función metabólica mejorada y una posible reducción del daño oxidativo [37]. Este estudio evaluó los efectos de la kinetina en combinación con 2,4-D y nanopartículas de Fe₃O₄ en el crecimiento y desarrollo del callo de hipérico (Fig. 3a–g). Estudios previos han demostrado que las nanopartículas de Fe₃O₄ tienen actividades antifúngicas y antimicrobianas [38, 39] y, cuando se usan en combinación con reguladores del crecimiento vegetal, pueden estimular los mecanismos de defensa de la planta y reducir los índices de estrés celular [18]. Aunque la biosíntesis de metabolitos secundarios está regulada genéticamente, su rendimiento real depende en gran medida de las condiciones ambientales. Los cambios metabólicos y morfológicos pueden influir en los niveles de metabolitos secundarios regulando la expresión de genes vegetales específicos y respondiendo a factores ambientales. Además, los inductores pueden activar nuevos genes, que a su vez estimulan la actividad enzimática, activando múltiples vías biosintéticas y dando lugar a la formación de metabolitos secundarios. Asimismo, otro estudio demostró que la reducción de la sombra aumenta la exposición a la luz solar, elevando así las temperaturas diurnas en el hábitat natural de *Hypericum perforatum*, lo que también contribuye a un mayor rendimiento de hipericina. Con base en estos datos, este estudio investigó el papel de las nanopartículas de hierro como posibles inductores en el cultivo de tejidos. Los resultados mostraron que estas nanopartículas pueden activar genes implicados en la biosíntesis de hesperidina mediante estimulación enzimática, lo que conlleva una mayor acumulación de este compuesto (Fig. 2). Por lo tanto, en comparación con las plantas que crecen en condiciones naturales, se puede argumentar que la producción de dichos compuestos in vivo también puede mejorarse cuando se combina un estrés moderado con la activación de genes implicados en la biosíntesis de metabolitos secundarios. Los tratamientos combinados generalmente tienen un efecto positivo en la tasa de regeneración, pero en algunos casos, este efecto se debilita. En particular, el tratamiento con 1 mg/L de 2,4-D, 1,5 mg/L de quinasa y diferentes concentraciones podrían aumentar de forma independiente y significativa la tasa de regeneración en un 50,85% en comparación con el grupo de control (Fig. 4c). Estos resultados sugieren que combinaciones específicas de nanohormonas pueden actuar sinérgicamente para promover el crecimiento de la planta y la producción de metabolitos, lo cual es de gran importancia para el cultivo de tejidos de plantas medicinales. Palmer y Keller [50] demostraron que el tratamiento con 2,4-D podía inducir de forma independiente la formación de callos en St. perforatum, mientras que la adición de quinasa mejoró significativamente la formación de callos y la regeneración. Este efecto se debió a la mejora del equilibrio hormonal y la estimulación de la división celular. Bal et al. [51] encontraron que el tratamiento con Fe₃O₄-NP podía mejorar de forma independiente la función de las enzimas antioxidantes, promoviendo así el crecimiento de la raíz en St. perforatum. Los medios de cultivo que contienen nanopartículas de Fe₃O₄ en concentraciones de 0,5 mg/L, 1 mg/L y 1,5 mg/L mejoraron la tasa de regeneración de plantas de lino [52]. El uso de kinetina, 2,4-diclorobenzotiazolinona y nanopartículas de Fe₃O₄ mejoró significativamente las tasas de formación de callos y raíces; sin embargo, es necesario considerar los posibles efectos secundarios del uso de estas hormonas para la regeneración in vitro. Por ejemplo, el uso prolongado o en altas concentraciones de 2,4-diclorobenzotiazolinona o kinetina puede provocar variación clonal somática, estrés oxidativo, morfología anormal del callo o vitrificación. Por lo tanto, una alta tasa de regeneración no predice necesariamente la estabilidad genética. Todas las plantas regeneradas deben evaluarse utilizando marcadores moleculares (por ejemplo, RAPD, ISSR, AFLP) o análisis citogenético para determinar su homogeneidad y similitud con las plantas in vivo [53,54,55].
Este estudio demostró por primera vez que el uso combinado de reguladores del crecimiento vegetal (2,4-D y kinetina) con nanopartículas de Fe₃O₄ puede potenciar la morfogénesis y la acumulación de metabolitos bioactivos clave (incluyendo hipericina e hiperósido) en *Hypericum perforatum*. El régimen de tratamiento optimizado (1 mg/L de 2,4-D + 1 mg/L de kinetina + 4 mg/L de nanopartículas de Fe₃O₄) no solo maximizó la formación de callos, la organogénesis y el rendimiento de metabolitos secundarios, sino que también demostró un leve efecto inductor, lo que podría mejorar la tolerancia al estrés y el valor medicinal de la planta. La combinación de nanotecnología y cultivo de tejidos vegetales proporciona una plataforma sostenible y eficiente para la producción in vitro a gran escala de compuestos medicinales. Estos resultados abren el camino a aplicaciones industriales e investigaciones futuras sobre mecanismos moleculares, optimización de dosis y precisión genética, vinculando así la investigación fundamental sobre plantas medicinales con la biotecnología práctica.
Fecha de publicación: 12 de diciembre de 2025
