Los pesticidas desempeñan un papel fundamental para abordar la escasez mundial de alimentos y combatir las enfermedades humanas transmitidas por vectores. Sin embargo, el creciente problema de la resistencia a los pesticidas requiere urgentemente el descubrimiento de nuevos compuestos que se dirijan a dianas infrautilizadas. Los canales de potencial receptor transitorio (TRPV) de insectos, Nanzhong (Nan) e inactivo (Iav), pueden formar canales heterólogos (Nan-Iav) y localizarse en órganos mecanosensoriales que median el geotropismo, la audición y la propiocepción en los insectos. Algunos pesticidas, como la afidopirrolidona (AP), se dirigen a Nan-Iav a través de mecanismos desconocidos. La AP es eficaz contra insectos perforadores-chupadores (hemípteros), impidiendo la alimentación al interrumpir la función de los filamentos. La AP puede unirse solo a Nan, pero solo Nan-Iav puede interactuar con agonistas, incluida la nicotinamida endógena (NAM), exhibiendo así actividad de canal. A pesar del potencial de Nan-Iav como diana insecticida, se conoce poco sobre el ensamblaje de sus canales, sus sitios de unión reguladores y su regulación dependiente de Ca2+, lo que dificulta el desarrollo de insecticidas. En este estudio, se utilizó criomicroscopía electrónica para determinar la estructura de Nan-Iav en insectos hemípteros en estado libre de ligando de calmodulina, así como con AP y NAM en el límite del dominio citoplasmático de repetición de anquirina (ARD). Sorprendentemente, descubrimos que la proteína Nan puede formar un pentámero, que se estabiliza mediante interacciones de ARD mediadas por AP. Este estudio revela interacciones moleculares entre insecticidas y agonistas y Nan-Iav, destacando la importancia de ARD en la función y el ensamblaje de canales, y explorando el mecanismo de regulación de Ca2+.
En el contexto de un cambio climático global cada vez más severo, el deterioro de la seguridad alimentaria mundial es uno de los principales desafíos del siglo XXI, con consecuencias en cadena para la sociedad.1,2El informe El estado de la seguridad alimentaria y la nutrición en el mundo 2023 (SOFI) de la Organización Mundial de la Salud estima que aproximadamente 2.330 millones de personas en todo el mundo padecen inseguridad alimentaria de moderada a grave, un problema de larga data.3,4Lamentablemente, se estima que entre el 20% y el 30% o más del rendimiento de los cultivos se pierde anualmente debido a plagas y patógenos, y se espera que el calentamiento global exacerbe la resistencia a las plagas y la vulnerabilidad de los cultivos.4,5,6,7,8El desarrollo de pesticidas es fundamental no sólo para proteger los cultivos de las plagas y reducir la propagación de patógenos transmitidos por vectores, sino también para combatir enfermedades humanas transmitidas por vectores, como el dengue, la malaria y la enfermedad de Chagas, que son cada vez más resistentes a los pesticidas.5,9,10,11
Entre los principales objetivos de los insecticidas neurotóxicos, el canal TRPV heterotetramérico Nanchung (Nan)-Inactivo (Iav) representa una clase de objetivos insecticidas descubiertos recién en la última década, incluidos insecticidas disponibles comercialmente como imidacloprid y piraclostrobina.12, 13, 14El insecticida semisintético afidopirrolifeno (AP) es un producto recientemente desarrollado y comercializado cuyo componente principal es el insecticida activo Inscalis®, que se une al AP a un nivel de actividad subnanomolar.15El AP exhibe una baja toxicidad aguda para los polinizadores, insectos benéficos y otros organismos no objetivo, y cuando se usa según las instrucciones de la etiqueta, puede reducir la presión de resistencia a otros insecticidas.16, 17, 18Nan e Iav están ampliamente distribuidos entre las especies de insectos, se coexpresan solo en las neuronas receptoras de estiramiento cordal de las antenas y las extremidades, y son fundamentales para la audición, la percepción de la gravedad y la propiocepción.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid y piraclostrobina estimulan el complejo Nan-Iav a través de un mecanismo único, inhibiendo en última instancia la transducción de señales propioceptivas.13,16,23En los insectos perforadores-chupadores (hemípteros), como los pulgones y las moscas blancas, la pérdida de la propiocepción perjudica su capacidad de alimentación y, en última instancia, conduce a la muerte.13,24Curiosamente, el AP muestra alta afinidad por el complejo Nan-Iav y baja afinidad por Nan solo. La unión del AP a Nan-Iav induce una corriente eléctrica, pero la unión a Nan por sí sola no estimula la actividad del canal. El Iav en sí no se une al AP.16Esto sugiere que Nan e Iav pueden unirse para formar diferentes complejos de canales Nan-Iav (p. ej., con diferentes proporciones estequiométricas o diferentes disposiciones dentro de la misma proporción estequiométrica) o que AP puede unirse a múltiples sitios. Además, el agonista natural nicotinamida (NAM) se une a Nan-Iav de Drosophila con afinidad micromolar, exhibiendo efectos similares a los de los áfidos (AP) in vitro.16,25e inhibiendo la reproducción y alimentación de los pulgones, lo que en última instancia conduce a su muerte.25,26Estos datos plantean numerosas preguntas. Por ejemplo, aún no se ha aclarado cómo se forma el heterodímero Nan-Iav, qué sitios de unión se utilizan para modular moléculas pequeñas y cómo estas regulan la función del canal mediante la supresión de la propiocepción. Además, aún no se han esclarecido las razones por las que Nan es inactivo y presenta baja afinidad por el AP, mientras que el heterodímero Nan-Iav es activo y se une al AP con mayor afinidad. Finalmente, se sabe poco sobre la regulación dependiente de Ca₂₄ de la función Nan-Iav y cómo se integra en los procesos de señalización neuronal.. 13,21
En este estudio, que combina criomicroscopía electrónica, electrofisiología y técnicas de unión de radioligandos, dilucidamos el ensamblaje de Nan-Iav y el mecanismo de su unión a reguladores de moléculas pequeñas. Además, detectamos calmodulina (CaM) unida constitutivamente a pentámeros de Nan estabilizados con Iav y AP. Estos resultados proporcionan información importante sobre la regulación de los iones de calcio en los canales, el ensamblaje de canales y los factores que determinan la afinidad de unión a ligandos. Más importante aún, confirmamos que el ARD desempeña un papel central en estos procesos. Nuestro estudio de canales completos de insectos unidos a pesticidas agrícolas relevantes.27, 28, 29abre perspectivas para el desarrollo de la industria de plaguicidas, mejorando la eficacia y especificidad de los plaguicidas y permitiendo la aplicación de compuestos dirigidos contra el TRPV a otras especies para abordar la seguridad alimentaria mundial y la propagación de enfermedades transmitidas por vectores.
También descubrimos que Nan-Iav está regulado por Ca₂₄, y que el mecanismo de regulación está mediado por la CaM unida constitutivamente. Cabe destacar que esta regulación de Nav dependiente de Ca₂₄ por CaM difiere significativamente de los mecanismos de regulación de otros canales iónicos (p. ej., los canales de Na₂ dependientes de voltaje y los canales TRPV5/6).52,53,54,55,56,57En el canal Nav1.2, el dominio C-terminal de CaM se asocia helicoidalmente con el dominio C-terminal (CTD), y Ca2+ induce la unión de su dominio N-terminal a la porción distal del CTD.56En el canal TRPV5/6, el dominio C-terminal de CaM se une a CTH, y Ca2+ induce la extensión ascendente de su dominio N-terminal hacia el poro, bloqueando así la permeabilidad de los cationes.53,54Proponemos un modelo para la función regulada por Ca2+ de Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). En este modelo, el dominio N-terminal de CaM se une constitutivamente al dominio C-terminal (CTH) de Iav. En estado de reposo (baja concentración de [Ca2+]), el dominio C-terminal de CaM interactúa con Nan, estabilizando la conformación de ARD y promoviendo así la apertura del canal. La unión de un agonista/insecticida al canal induce la apertura del poro, lo que conduce a la entrada de Ca2+. El Ca2+ se une entonces a CaM, causando la disociación del dominio C-terminal del ARD de Nan. Dado que el bloqueo de la unión de CaM esencialmente elimina el efecto inhibidor del Ca2+, esta disociación modula la movilidad del ARD, causando así inhibición o desensibilización dependiente de Ca2+. La rápida recuperación de las corrientes de los canales tras la elución de iones de calcio (Fig. 4g) sugiere que este mecanismo facilita respuestas rápidas a las señales neuronales mediadas por Ca₂₄. Además, se ha descrito que la región C-terminal de Iav, aún poco conocida, desempeña otras funciones en la focalización de los canales y la regulación de la corriente.21
Finalmente, nuestro estudio presenta la estructura de alta resolución de un complejo de canales TRP insecticida-insecticida de importancia agrícola, un descubrimiento previamente desconocido. Cabe destacar que caracterizamos la estructura y función del canal de insectos en células humanas (HEK293S GnTi–) en lugar de células de insectos. Ante la creciente resistencia a los insecticidas y la presión continua sobre la seguridad alimentaria y los patógenos, nuestro trabajo proporciona información importante que facilitará el desarrollo de nuevos insecticidas en beneficio de la salud humana y la seguridad alimentaria mundial. Estudios han demostrado que insecticidas como AP son eficaces contra algunas plagas cuando se usan según las instrucciones de la etiqueta y presentan baja toxicidad aguda para los polinizadores benéficos, lo que demuestra su seguridad ambiental.13,16Además, las pruebas de algunos derivados de AP en mosquitos han demostrado que con el tiempo pierden su capacidad de volar. Comprender cómo estos compuestos moduladores se unen a Nan-Iav facilitará la modificación de compuestos existentes o el desarrollo de nuevos compuestos para lograr una mayor eficacia.precisoControl de plagas. Nuestro estudio demuestra que la interfaz ARD Nan-Iav es crucial no solo para regular la actividad de compuestos endógenos, pesticidas y Ca₂₄-CaM, sino también para el ensamblaje de canales. Sugerimos que la interrupción del ensamblaje de heterodímeros con moléculas pequeñas podría ser un enfoque único y prometedor para el desarrollo de inhibidores de canales iónicos.
De los ocho genes ortólogos, se seleccionaron los genes completos del escarabajo pardo (Halyomorpha halys) Nanchung e Inactive, que mostraron una excelente estabilidad en detergentes. Los genes sintetizados se optimizaron por codones para la expresión humana y se clonaron en el vector pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) utilizando los sitios de restricción XhoI y EcoRI. Esto aseguró que los clones estuvieran en marco con las etiquetas C-terminales GFP-FLAG-10xHis y mCherry-FLAG-10xHis, que son escindidas por la proteasa HRC-3C (PPX), lo que permite la expresión independiente.expresiónLos cebadores utilizados para clonar Nanchung e Inactive en el vector pBacMam fueron los siguientes:
Se obtuvieron imágenes microscópicas de partículas individuales con un microscopio electrónico de transmisión (FEI) Titan Krios G2 equipado con una cámara K3 y un filtro de energía Gatan BioQuantum. El microscopio se operó a 300 keV, con un ajuste de energía de 20 eV, un tamaño de píxel de muestra de 1,08 Å/píxel (aumento nominal de 81 000x) y un gradiente de desenfoque de -0,8 a -2,2 μm. La grabación de vídeo se realizó a 40 fotogramas por segundo con un microscopio Latitude S (Gatan) con una tasa de dosis nominal de 25 e–px−1 s−1, un tiempo de exposición de 2,4 s y una dosis total de aproximadamente 60 e–Å−2.
La corrección del movimiento inducido por el haz y la ponderación de la dosis se realizaron en película utilizando MotionCor2 en RELION 4.061. La estimación del parámetro de la función de transferencia de contraste (CTF) se realizó en cryoSPARC utilizando el método de estimación de CTF basado en parches62. Las fotomicrografías con una resolución de ajuste de CTF ≥4 Å se excluyeron del análisis posterior. Típicamente, se utilizó un subconjunto de 500-1000 fotomicrografías para la selección de puntos en cryoSPARC, seguido de varias rondas de clasificación 2D después del filtrado para obtener una imagen de referencia clara para la selección de partículas basada en plantillas. Luego, las partículas se extrajeron utilizando cuadros delimitadores de 64 píxeles y binning de 4 pliegues. Se realizaron varias rondas de clasificación 2D para eliminar categorías de partículas no deseadas. El modelo 3D inicial se reconstruyó utilizando reconstrucción ab initio y se refinó utilizando refinamiento no uniforme en cryoSPARC. La clasificación 3D se realizó en cryoSPARC o RELION según la heterogeneidad de ARD. No se observó heterogeneidad significativa en los dominios de membrana. Las partículas se refinaron mediante los métodos C1 y C2; las partículas con mayor resolución C2 se consideraron simétricas con respecto a C2 y se importaron a RELION para su refinamiento bayesiano. Posteriormente, las partículas se transfirieron de nuevo a cryoSPARC para su refinamiento final no uniforme y local. La resolución final y el recuento de partículas se muestran en la Tabla 1.
Al procesar pentámeros Nan+AP, exploramos diversos métodos para mejorar la resolución de los dominios de membrana (especialmente la región porosa), como la sustracción de señal y el enmascaramiento de TMD. Sin embargo, estos intentos no tuvieron éxito debido al desorden potencialmente extremo en la región porosa y a la heterogeneidad general del TMD. La resolución final se calculó utilizando una máscara generada automáticamente por el método de procesamiento no uniforme en cryoSPARC, dirigida principalmente a la región ARD. Esto logró una resolución significativamente mayor que la de los dominios de membrana (especialmente la región VSLD).
Los modelos iniciales de novo de las formas apo de los insectos Nanchung e Inactivos se generaron primero con Coot63, y los modelos de los insectos Nan e Iav se generaron con AlphaFold264 para identificar regiones de baja confianza. El modelado de calmodulina se basó en ajustes de cuerpo rígido de los modelos de unión a Ca₂₄ y libre de Ca₂₄ en las accesiones PDB 4JPZ56 y 1CFD65, respectivamente. Los modelos se refinaron mediante refinamiento esférico para asegurar la estereoquímica correcta y una buena geometría. La fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina se modelaron posteriormente como densidades lipídicas bien definidas, y los ligandos NAM y AP se colocaron en las densidades correspondientes en las uniones estrechas. Los archivos de restricción se generaron a partir de la cadena SMILES de las isoformas utilizando eLBOW en PHENIX66. Finalmente, los modelos se refinaron en el espacio real en PHENIX mediante búsqueda de cuadrícula local y minimización global con restricciones de estructura secundaria. El servidor MolProbity se utilizó para el refinamiento del modelo y el análisis estructural, y las ilustraciones se realizaron con PyMOL y UCSF Chimera X. 67,68,69 El análisis de apertura se realizó con el servidor HOLE,70 y el mapeo de conservación de secuencias con el servidor Consurf.71
El análisis estadístico se realizó con Igor Pro 6.2, Excel Office 365 y GraphPad Prism 7.0. Todos los datos cuantitativos se presentan como media ± error estándar (SEM). Se utilizó la prueba t de Student (bilateral, no pareada) para comparar dos grupos. Se utilizó un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnett para comparar múltiples grupos. *P< 0,05, **P< 0,01 y ***PLos valores < 0,001 se consideraron estadísticamente significativos según la distribución de los datos. Los valores de Kd y Ki, así como sus intervalos de confianza asimétricos del 95 %, se calcularon con GraphPad Prism 10.
Para obtener más detalles sobre la metodología del estudio, consulte el resumen del informe de Nature Portfolio vinculado en este artículo.
El modelo inicial se construyó utilizando los modelos de calmodulina de las bases de datos PDB 4JPZ y 1CFD. Las coordenadas se depositaron en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) con los números de acceso 9NVN (Nan-Iav-CaM sin ligando), 9NVO (Nan-Iav-CaM unida a nicotinamida), 9NVP (Nan-Iav-CaM unida a nicotinamida y EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM unida a afenidolpirrolina y calcio), 9NVR (Nan-Iav-CaM unida a afenidolpirrolina y EDTA) y 9NVS (Nan pentámero unido a afenidolpirrolina). Las imágenes de criomicroscopía electrónica correspondientes se encuentran depositadas en la Base de Datos de Microscopía Electrónica (EMDB) con los siguientes números de acceso: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sin ligando), EMD-49845 (complejo Nan-Iav-CaM con nicotinamida), EMD-49846 (complejo Nan-Iav-CaM con nicotinamida y EDTA), EMD-49847 (complejo Nan-Iav-CaM con afidopirrolina y calcio), EMD-49848 (complejo Nan-Iav-CaM con afidopirrolina y EDTA) y EMD-49849 (complejo de pentámero Nan con afidopirrolina). En este artículo se presentan los datos brutos para el análisis funcional.
Hora de publicación: 28 de enero de 2026