Los plaguicidas desempeñan un papel fundamental para abordar la escasez mundial de alimentos y combatir las enfermedades humanas transmitidas por vectores. Sin embargo, el creciente problema de la resistencia a los plaguicidas exige urgentemente el descubrimiento de nuevos compuestos que actúen sobre dianas poco exploradas. Los canales de potencial de receptor transitorio (TRPV) de los insectos —Nanzhong (Nan) e inactivo (Iav)— pueden formar canales heterólogos (Nan-Iav) y localizarse en órganos mecanosensoriales que median el geotropismo, la audición y la propiocepción en los insectos. Algunos plaguicidas, como la afidopirrolidona (AP), actúan sobre Nan-Iav mediante mecanismos desconocidos. La AP es eficaz contra los insectos chupadores perforadores (hemípteros), ya que impide su alimentación al interrumpir la función de los filamentos. La AP solo puede unirse a Nan, pero solo Nan-Iav puede interactuar con agonistas, incluida la nicotinamida endógena (NAM), exhibiendo así actividad de canal. A pesar del potencial de Nan-Iav como diana para insecticidas, se sabe poco sobre el ensamblaje de su canal, sus sitios de unión reguladores y su regulación dependiente de Ca2+, lo que dificulta el desarrollo de nuevos insecticidas. En este estudio, se utilizó microscopía crioelectrónica para determinar la estructura de Nan-Iav en insectos hemípteros en ausencia del ligando de calmodulina, así como con AP y NAM en el límite del dominio citoplasmático de repetición de anquirina (ARD). Sorprendentemente, se descubrió que la proteína Nan puede formar un pentámero, estabilizado por interacciones ARD mediadas por AP. Este estudio revela interacciones moleculares entre insecticidas, agonistas y Nan-Iav, destacando la importancia del ARD en la función y el ensamblaje del canal, y explorando el mecanismo de regulación por Ca2+.
En el contexto de un cambio climático global cada vez más severo, el deterioro de la seguridad alimentaria mundial es uno de los principales desafíos del siglo XXI, con consecuencias en cascada para la sociedad.1,2El informe "El estado de la seguridad alimentaria y la nutrición en el mundo 2023" (SOFI, por sus siglas en inglés) de la Organización Mundial de la Salud estima que aproximadamente 2330 millones de personas en todo el mundo sufren de inseguridad alimentaria de moderada a grave, un problema de larga data.3,4Lamentablemente, se estima que entre el 20% y el 30% o más de las cosechas se pierden anualmente a causa de plagas y patógenos, y se prevé que el calentamiento global exacerbe la resistencia de las plagas y la vulnerabilidad de los cultivos.4,5,6,7,8El desarrollo de plaguicidas es fundamental no solo para proteger los cultivos de las plagas y reducir la propagación de patógenos transmitidos por vectores, sino también para combatir enfermedades humanas transmitidas por vectores, como el dengue, la malaria y la enfermedad de Chagas, que son cada vez más resistentes a los plaguicidas.5,9,10,11
Entre los principales objetivos de los insecticidas neurotóxicos, el canal heterotetramérico TRPV Nanchung (Nan)-Inactivo (Iav) representa una clase de objetivos de insecticidas descubiertos solo en la última década, incluidos insecticidas disponibles comercialmente como el imidacloprid y la piraclostrobina.12,13,14El insecticida semisintético afidopirrolifeno (AP) es un producto de reciente desarrollo y comercialización cuyo componente principal es el insecticida activo Inscalis®, que se une al AP a un nivel de actividad subnanomolar.15El AP presenta una baja toxicidad aguda para los polinizadores, los insectos beneficiosos y otros organismos no objetivo, y cuando se utiliza de acuerdo con las instrucciones de la etiqueta, puede reducir la presión de resistencia a otros insecticidas.16,17,18Los genes Nan e Iav están ampliamente distribuidos entre las especies de insectos, se coexpresan únicamente en las neuronas receptoras de estiramiento cordal de las antenas y las extremidades, y son fundamentales para la audición, la percepción de la gravedad y la propiocepción.13,16,19,20,21,22La AP, el imidacloprid y la piraclostrobina estimulan el complejo Nan-Iav mediante un mecanismo único, inhibiendo finalmente la transducción de la señal propioceptiva.13,16,23En los insectos perforadores-chupadores (hemípteros), como los pulgones y las moscas blancas, la pérdida de la propiocepción perjudica su capacidad de alimentación, lo que finalmente les provoca la muerte.13,24Curiosamente, AP muestra una alta afinidad por el complejo Nan-Iav y una baja afinidad por Nan solo. La unión de AP a Nan-Iav induce una corriente eléctrica, pero la unión a Nan solo no estimula la actividad del canal. Iav por sí mismo no se une a AP en absoluto.16Esto sugiere que Nan e Iav podrían unirse para formar diferentes complejos de canales Nan-Iav (por ejemplo, con diferentes proporciones estequiométricas o diferentes disposiciones dentro de la misma proporción estequiométrica) o que AP podría unirse a múltiples sitios. Además, el agonista natural nicotinamida (NAM) se une a Drosophila Nan-Iav con afinidad micromolar, exhibiendo efectos similares a los de los áfidos (AP) in vitro.16,25e inhibiendo la reproducción y la alimentación de los pulgones, lo que finalmente provoca su muerte.25,26Estos datos plantean muchas preguntas. Por ejemplo, aún no está claro cómo se forma el heterodímero Nan-Iav, qué sitios de unión se utilizan para modular moléculas pequeñas y cómo estas moléculas regulan la función del canal suprimiendo la propiocepción. Además, las razones por las que Nan en sí mismo está inactivo y tiene baja afinidad por AP, mientras que el heterodímero Nan-Iav está activo y se une a AP con mayor afinidad, siguen sin estar claras. Finalmente, se sabe poco sobre la regulación dependiente de Ca2+ de la función de Nan-Iav y cómo se integra en los procesos de señalización neuronal.. 13,21
En este estudio, combinando microscopía crioelectrónica, electrofisiología y técnicas de unión de radioligandos, dilucidamos el ensamblaje de Nan-Iav y el mecanismo de su unión a reguladores de moléculas pequeñas. Además, detectamos calmodulina (CaM) unida constitutivamente a Iav y pentámeros de Nan estabilizados por AP. Estos resultados proporcionan información importante sobre la regulación de los iones de calcio en los canales, el ensamblaje de canales y los factores que determinan la afinidad de unión del ligando. Más importante aún, confirmamos que ARD desempeña un papel central en estos procesos. Nuestro estudio de canales de insectos completos unidos a pesticidas agrícolas relevantes27, 28, 29Esto abre perspectivas para el desarrollo de la industria de los plaguicidas, mejorando la eficacia y la especificidad de los mismos, y permitiendo la aplicación de compuestos dirigidos al TRPV a otras especies para abordar la seguridad alimentaria mundial y la propagación de enfermedades transmitidas por vectores.
También descubrimos que Nan-Iav está regulado por Ca2+, y que el mecanismo de regulación está mediado por CaM unida constitutivamente. Es importante destacar que esta regulación de Nav dependiente de Ca2+ por CaM difiere significativamente de los mecanismos de regulación de otros canales iónicos (por ejemplo, canales de Na+ dependientes de voltaje y canales TRPV5/6).52,53,54,55,56,57En el canal Nav1.2, el dominio C-terminal de CaM se asocia helicoidalmente con el dominio C-terminal (CTD), y el Ca2+ induce la unión de su dominio N-terminal a la porción distal del CTD.56En el canal TRPV5/6, el dominio C-terminal de CaM se une a CTH, y el Ca2+ induce la extensión hacia arriba de su dominio N-terminal dentro del poro, bloqueando así la permeabilidad de los cationes.53,54Proponemos un modelo para la función regulada por Ca2+ del complejo Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). En este modelo, el dominio N-terminal de CaM se une constitutivamente al dominio C-terminal (CTH) de Iav. En estado de reposo (baja concentración de [Ca2+]), el dominio C-terminal de CaM interactúa con Nan, estabilizando la conformación del ARD y, por lo tanto, promoviendo la apertura del canal. La unión de un agonista/insecticida al canal induce la apertura del poro, lo que provoca la entrada de Ca2+. El Ca2+ se une entonces a CaM, causando la disociación del dominio C-terminal del ARD de Nan. Dado que el bloqueo de la unión de CaM prácticamente anula el efecto inhibidor del Ca2+, esta disociación modula la movilidad del ARD, provocando así una inhibición o desensibilización dependiente de Ca2+. La rápida recuperación de las corrientes del canal tras la elución de iones de calcio (Fig. 4g) sugiere que este mecanismo facilita las respuestas rápidas a las señales neuronales mediadas por Ca2+. Además, se ha informado que la región C-terminal de Iav, que aún no se comprende del todo, desempeña otras funciones en la localización del canal y la regulación de la corriente.21
Finalmente, nuestro estudio presenta la estructura de alta resolución de un complejo de canales TRP insecticida-insecticida de importancia agrícola, un descubrimiento previamente desconocido para nosotros. Cabe destacar que caracterizamos la estructura y función del canal insecticida en células humanas (HEK293S GnTi–) en lugar de en células de insectos. Ante la creciente resistencia a los insecticidas y la presión constante sobre la seguridad alimentaria y los patógenos, nuestro trabajo proporciona información importante que facilitará el desarrollo de nuevos insecticidas en beneficio de la salud humana y la seguridad alimentaria mundial. Los estudios han demostrado que insecticidas como el AP son eficaces contra algunas plagas cuando se usan según las instrucciones de la etiqueta y tienen baja toxicidad aguda para los polinizadores beneficiosos, lo que demuestra su seguridad ambiental.13,16Además, las pruebas de algunos derivados de AP en mosquitos han demostrado que eventualmente pierden su capacidad de volar. Comprender cómo estos compuestos moduladores se unen a Nan-Iav facilitará la modificación de los compuestos existentes o el desarrollo de nuevos compuestos para una mayor eficacia yprecisoControl de plagas. Nuestro estudio demuestra que la interfaz Nan-Iav ARD es fundamental no solo para regular la actividad de compuestos endógenos, pesticidas y Ca2+-CaM, sino también para el ensamblaje del canal. Sugerimos que interrumpir el ensamblaje del heterodímero con moléculas pequeñas podría ser un enfoque único y prometedor para el desarrollo de inhibidores de canales iónicos.
De los ocho genes ortólogos, se seleccionaron los genes completos del escarabajo marrón (Halyomorpha halys) Nanchung e Inactive, que mostraron una excelente estabilidad en detergentes. Los genes sintetizados se optimizaron mediante la optimización de codones para su expresión en humanos y se clonaron en el vector pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) utilizando los sitios de restricción XhoI y EcoRI. Esto aseguró que los clones estuvieran en fase con las etiquetas C-terminales GFP-FLAG-10xHis y mCherry-FLAG-10xHis, que son escindidas por la proteasa HRC-3C (PPX), lo que permite la expresión independiente.expresiónLos cebadores utilizados para clonar Nanchung e Inactive en el vector pBacMam fueron los siguientes:
Se obtuvieron imágenes microscópicas de partículas individuales con un microscopio electrónico de transmisión Titan Krios G2 (FEI) equipado con una cámara K3 y un filtro de energía Gatan BioQuantum. El microscopio se operó a 300 keV, con un ajuste de energía de 20 eV, un tamaño de píxel de muestra de 1,08 Å/píxel (aumento nominal de 81 000x) y un gradiente de desenfoque que oscilaba entre -0,8 y -2,2 μm. La grabación de vídeo se realizó a 40 fotogramas por segundo utilizando un microscopio Latitude S (Gatan) con una tasa de dosis nominal de 25 e–px−1 s−1, un tiempo de exposición de 2,4 s y una dosis total de aproximadamente 60 e–Å−2.
La corrección del movimiento inducido por el haz y la ponderación de la dosis se realizaron en película utilizando MotionCor2 en RELION 4.061. La estimación del parámetro de la función de transferencia de contraste (CTF) se realizó en cryoSPARC utilizando el método de estimación de CTF basado en parches62. Las fotomicrografías con una resolución de ajuste de CTF ≥4 Å se excluyeron del análisis posterior. Normalmente, se utilizó un subconjunto de 500–1000 fotomicrografías para la selección de puntos en cryoSPARC, seguido de varias rondas de clasificación 2D después del filtrado para obtener una imagen de referencia clara para la selección de partículas basada en plantillas. Luego, las partículas se extrajeron utilizando cuadros delimitadores de 64 píxeles y binning de 4 pliegues. Se realizaron varias rondas de clasificación 2D para eliminar categorías de partículas no deseadas. El modelo 3D inicial se reconstruyó utilizando reconstrucción ab initio y se refinó utilizando refinamiento no uniforme en cryoSPARC. La clasificación 3D se realizó en cryoSPARC o RELION en función de la heterogeneidad de ARD. No se observó heterogeneidad significativa en los dominios de membrana. Las partículas se refinaron mediante los métodos C1 y C2; aquellas con mayor resolución C2 se consideraron simétricas con respecto a C2 y se importaron a RELION para su refinamiento bayesiano. Posteriormente, las partículas se transfirieron de nuevo a cryoSPARC para su refinamiento final no uniforme y local. La resolución final y el número de partículas se muestran en la Tabla 1.
Al procesar pentámeros Nan+AP, exploramos diversos métodos para mejorar la resolución de los dominios de membrana (especialmente la región del poro), como la sustracción de señal y el enmascaramiento de TMD. Sin embargo, estos intentos no tuvieron éxito debido al desorden potencialmente extremo en la región del poro y la heterogeneidad general del TMD. La resolución final se calculó utilizando una máscara generada automáticamente por el método de procesamiento no uniforme en cryoSPARC, dirigida principalmente a la región ARD. Esto permitió obtener una resolución significativamente mayor que la de los dominios de membrana (especialmente la región VSLD).
Los modelos iniciales de novo de las formas apo de los bacilos Nanchung e Inactivos se generaron primero usando Coot63, y los modelos de los bacilos Nan e Iav se generaron usando AlphaFold264 para identificar regiones de baja confianza. El modelado de la calmodulina se basó en ajustes de cuerpo rígido de los modelos con y sin Ca2+ en los accesos PDB 4JPZ56 y 1CFD65, respectivamente. Los modelos se refinaron usando refinamiento esférico para asegurar la estereoquímica correcta y una buena geometría. Luego, la fosfatidilcolina, la fosfatidiletanolamina y la fosfatidilserina se modelaron como densidades lipídicas bien definidas, y los ligandos NAM y AP se colocaron en las densidades correspondientes en las uniones estrechas. Los archivos de restricciones se generaron a partir de la cadena SMILES de las isoformas usando eLBOW en PHENIX66. Finalmente, los modelos se refinaron en el espacio real en PHENIX mediante búsqueda en cuadrícula local y minimización global con restricciones de estructura secundaria. El servidor MolProbity se utilizó para el refinamiento del modelo y el análisis estructural, y las ilustraciones se realizaron con PyMOL y UCSF Chimera X. 67,68,69 El análisis de apertura se realizó con el servidor HOLE,70 y el mapeo de conservación de secuencias se realizó con el servidor Consurf.71
El análisis estadístico se realizó utilizando Igor Pro 6.2, Excel Office 365 y GraphPad Prism 7.0. Todos los datos cuantitativos se presentan como media ± error estándar (SEM). Se utilizó la prueba t de Student (bilateral, no pareada) para comparar dos grupos. Se utilizó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba post hoc de Dunnett para comparar múltiples grupos. *P< 0,05, **P< 0,01 y ***PLos valores < 0,001 se consideraron estadísticamente significativos según la distribución de los datos. Los valores de Kd y Ki, así como sus intervalos de confianza asimétricos del 95 %, se calcularon utilizando GraphPad Prism 10.
Para obtener más detalles sobre la metodología del estudio, consulte el resumen del informe de Nature Portfolio que se incluye en este artículo.
El modelo inicial se construyó utilizando los modelos de calmodulina de las bases de datos PDB 4JPZ y 1CFD. Las coordenadas se han depositado en el Protein Data Bank (PDB) con los números de acceso 9NVN (Nan-Iav-CaM sin ligando), 9NVO (Nan-Iav-CaM unido a nicotinamida), 9NVP (Nan-Iav-CaM unido a nicotinamida y EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM unido a afenidolpirrolina y calcio), 9NVR (Nan-Iav-CaM unido a afenidolpirrolina y EDTA) y 9NVS (pentámero de Nan unido a afenidolpirrolina). Las imágenes correspondientes de criomicroscopía electrónica se encuentran depositadas en la base de datos de microscopía electrónica (EMDB) con los siguientes números de acceso: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sin ligando), EMD-49845 (complejo Nan-Iav-CaM con nicotinamida), EMD-49846 (complejo Nan-Iav-CaM con nicotinamida y EDTA), EMD-49847 (complejo Nan-Iav-CaM con afidopirrolina y calcio), EMD-49848 (complejo Nan-Iav-CaM con afidopirrolina y EDTA) y EMD-49849 (complejo de pentámero Nan con afidopirrolina). Los datos brutos para el análisis funcional se presentan en este artículo.
Fecha de publicación: 28 de enero de 2026
